Возможность использования функционального клонирования зависит от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль- шинства моногенных болезней определение первичного биохими- ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу из-за недостаточного понимания функционирования огромного числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия, низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе- ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи- мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно- го клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе- зусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возмож- ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8 представлена общая схема позиционного клонирования, за- имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена более точная локализациия может быть установлена с помощью при- цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде- ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп- ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель- но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци- енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно- го такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генети- ческими маркерами целого генома и позволит перейти не- посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об- разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза, миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней- рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли- тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод

"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож- дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи- ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель- ному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди ко- торых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные забо- левания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нук- леотидных последовательностей кодирующих участков гомологич- ных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффектив- ность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).

Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной ак- тивности соответствующих белков, которые возникают в резуль- тате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.

Отметим только, что в настоящее время подобные исследования стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний человека, для которых идентифицированы геномные последова- тельности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол- норазмерные кДНК-последовательности.

Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.

Международная программа "Геном человека".

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, локализации и функ- циях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в

Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содер- жащих сводные данные о всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях под названием:

"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обоб- щенные в виде отдельных статей сведения о характере наследо- вания, функциях и размерах генов; методах их картирования и идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, по- лиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявле- ниях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а также о природе основного дефекта, включая патогенез и пато- физиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным ло- кусам с различным типом наследования и по генам наследствен- ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хро- мосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названи- ям генов или по наименованиям соответствующих генных болез- ней. Отдельно представлены данные по клонированным генам, для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом количество различных идентифицированных мутантных вариантов для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.

Издания содержат также список доступных мутантных клеточных линий.

Каждому локализованному менделирующему локусу в этой энциклопедии присвоен шестизначный номер (MIM), первая цифра которого определяет характер наследования: 1 - для аутосом- но-доминантных генов, 2 - для аутосомно-рецессивных, 3 и 4- для генов, локализованных в X- и в Y-хромосомах, соот- ветственно, 5 - для митохондриальных генов. Четыре цифры, следующие после точки непосредственно за шестизначным номе- ром, предназначены для кодирования различных мутантных вари- антов данного локуса. Издания выпускаются как в печатной форме, так и в компьютерном варианте (OMIM) на дискетах или на компакт-дисках. В последнем случае они снабжены програм- мами, позволяющими осуществлять поиск по любой позиции и проводить постоянное обновление энциклопедии текущей инфор- мацией. Программы OMIM совместимы с другими базами генети- ческих данных, в первую очередь, с GDB (Genome Data Base), содержащей полную информацию (включая последовательности

ДНК) обо всех картированных генах, ДНК-маркерах и ДНК-зондах человека, а также и с GenBank - полной базой данных всех из- вестных нуклеотидных gоследовательностей ДНК.

В последнем 11-ом издании энциклопедии МакКьюсика со- держатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах человека (McKusick, 1994). Из них 4458 генов с аутосомно-до- минантным характером наследования, 1730 - с аутосомно-ре- цессивным, 412 генов локализовано в X-хромосоме, 19 - в

Y-хромосоме и 59 - в митохондриальной ДНК. Для более чем

2800 картированных генов определена их функция. С моногенны- ми заболеваниями связано 770 картированных локусов, а общее число нозологических форм, для которых гены картированы, включает 933 заболевания. При этом более 420 генов наследственных болезней уже клонированы и для каждого из этих генов описано от одного до нескольких сотен мутантных вариантов аллелей, характеризующихся различным фенотипи- ческим проявлением.

Различные хромосомы и их участки картированы с разной степенью детализации. На самой крупной по размерам хромосоме

1 картировано вдвое меньше генов, чем на Х-хромосоме ( 200 и

400 соответственно). Плотность уже картированных генов в разных хромосомах очень неравномерна. Так, хромосома 19 со- держит 178 генов, тогда как хромосома 13 только 40, при этом первая больше второй. Хромосомы 17 и 18 примерно равны по величине, но на первой уже картировано 180 генов, а на вто- рой- только 26. На хромосоме 2 картировано примерно такое же количество генов (около 175), как и на втрое меньше её по размерам хромосоме 17. Существеные различия в числе картиро- ванных генов отмечаются и внутри различных участков хро- мосом. К примеру, 19 из 43 генов хромосомы 21 локализованы в сегменте 21q22.3, составляющем лишь 20% длинного плеча. Об- ласть 9q34 занимает 10% хромосомы 9, но содержит 27% генов -

38 из 141 (Antonarakis, 1994). Число подобных примеров не- равномерного распределения картированных генов по хромосо- мамс может быть значительно увеличено.

Более 10 лет тому назад был полностью просеквенирован митохондриальный геном (Anderson et al., 1981), состоящий из

16 569 нуклеотидов и содержащий 37 генов, 22 из которых это гены транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белко- вых генов, кодирующих субьединицы комплексов окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Следует отметить, что 56 субьеди- ниц этого комплекса кодируется ядерными генами (McKusick:

1994). Митохондриальная ДНК очень плотно насыщена кодирующи- ми участками, так как митохондриальные гены не содержат инт- ронов и имеют очень ограниченные размеры некодирующих флан- кирующих ДНК. В настоящее время описано достаточно много бо- лезней, связанных с мутациями в митохондриальном геноме, и все они развиваются вследствие нарушений в системе окисли- тельного фосфорилирования.

Мы уже упоминали о том, что в настоящее время проклони- ровано около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, вы- деленных из тканеспецифических библиотек генов и представля- ющих около 10-15% всех генов человека. Хотя этих последова- тельностей пока нет на картах генов, секвенирование, со- поставление с компьютерными базами данных и гибридизация in situ позволят уже в самое ближайшее время провести их иден- тификацию и локализацию (McKusick, Amberger, 1993).

Следует отметить, что каждый картированный ген и поли- морфный локус сами по себе автоматически становятся точками отсчета в геноме, то есть молекулярными маркерами. Наряду с этим, продолжается интенсивное насыщение генома новыми моле- кулярными маркерами типа STS ( sequence tagged sites) и мик- росателлитными повторами типа STR (short tandem repeats)

(cм. Главу II). К сентябрю 1994г Genome Database (GDB) вклю- чала 6691 STR-сайтов и 3 752 из них (56%) имели уровень ге- терозиготности более 60%. Карты сцепления для индексных мар- керов сконструированы, в основном, по результатам генотипи- рования сорока CEPH референтных семей (см.Глава II,2.3).

Среднее расстояние между соседними маркерами варьирует от 2 сМ для хромосомы 21 до 5 сМ для самых крупных хромосом с очень небольшим числом участков в геноме с расстоянием между маркерами большим, чем 10 сМ. GDB содержит 672 гена, локали- зованных на картах сцепления индексных маркеров, из общего числа 3485 клонированных генов (Guapay et al., 1994). Соз- данные в последние годы достаточно подробные геномные карты сцепления молекулярных маркеров в масштабах 13, 0; 5,0 и да- же 2,9 сантиморганид; автоматизация процесса генотипирования маркерных микросателлитных (STR) аллелей; большое число уже картированных структурных генов, анонимных ДНК-последова- тельностей значительно упрощают и, главное, ускоряют процесс генетического картирования. Если в 1992г. в распоряжении иследователей было только 814 динуклеотидных полиморфных сайтов (Weissenbach et al.,1992), то уже к маю 1994 г. их число возросло до 3 300 (Guyapay et al.,1994) , а к концу года - до 5 000- 6 000 (Shmitt, Goodfellow, 1994). Столь же быстрыми темпами нарастает число молекулярных маркеров и в геноме лабораторных мышей (Service, 1994). По всей види- мости, человек и лабораторная мышь будут первыми млекопитаю- щими с полностью расшифрованными геномами.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49