Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT
(или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клет- ки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день отсутствуют (см.Главу IX).
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловлен- ное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих
АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участ- вующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме, предположительно Германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и юве- нильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравни- тельно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной
Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеноч- ные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с позд- ним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных.
Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в
2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирую- щую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее иденти- фицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни
Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван
АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нукле- отидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что дока- зывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).
Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфо- узлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена
(6, 7, 8, 12 и 13).
Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мемб- ранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сай- та. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене
АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры, а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 - миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и
Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хро- мосом, соответственно (Thomas et al., 1995).
В заключении данного раздела представляется целесооб- разным кратко рассмотреть другие достаточно частые моноген- ные заболевания, для которых показана и проводится молеку- лярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме- дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лабора- тории молекулярной диагностики Институтата клинической гене- тики РАМН (Москва).
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит
21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-ре- цессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000 новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В за- висимости от характера нарушения функции гена и, соот- ветственно клинических проявлений "классическая форма" под- разделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая фор- ма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c из- бытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).
В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных
21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзо- не, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фак- тор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину
3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая сте- пень гомологии и тандемное расположение указвают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить, что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы
(называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитаю- щих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого ско- та функционально активны оба гена.
Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитох- ром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в
11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон.
В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез
АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогесте- рон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нару- шает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма).
Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и при- мерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечествен- ным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС, на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом, на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).
Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов, а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза
(Evgrafov et al., 1995).
10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.
Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессив- ное заболевание, характеризуется поражением моторных нейро- нов передних рогов спинного мозга, в результате чего разви- ваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища.
Это - второе после муковисцидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).
СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 ме- сяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип
II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять, но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма
(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой ал- лельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифи- цированного методом позиционного клонирования (см.Главу III) в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой ра- боте показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярным весом 32 КилоДальтона.
Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдоге- на) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отли- чить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследо- ванием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подверга- ется альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7.
Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229), его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся
3-х больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отме- тить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% боль- ных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует она 0 только у 4,4% 4 пациентов 0.
В непосредственной близости от теломерного конца гена
SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора зап- рогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах
СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.
Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозигот- ном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, 4при этом различ 4ия между 0форм 4ами 0СМА определяются двумя основными фак- торами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и cBCD541) - в случае Типа III), 2. наличием или отсутствием ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всех обследованных СМА-больных 4не
4обнаружены 0случа 4и одновременной 0делеции обоих гомологичных генов 4- 0SMN (tBCD541) и сBCD541 4, что 0указывает, по мнению авторов, 4на то, 0что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.
Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточне- ния, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молеку- лярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью прово- дится амплификация экона 7, который отсутствует у подавляю- щего большинства больных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) диф- ференцируют от мутантного варианта (ген cBCD541) c помощью
SSCP анализа. При необходимости возможна косвенная диаг- ностика - ПЦР анализ динуклеотидных (CA) повторов ДНК ло- кусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ с фланкирующими
ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1 : 22
-25 000) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующе- еся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген
АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9q13-q21) и физических картах ДНК-маркеров. На- иболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5
(зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области 4 0геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген
АФ. Определено положение гена ФА по отношению к другим флан- кирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes et al., 1991) 4. 0В настоящее время известно, по крайней мере,
5 таких ДНК маркеров: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные и мик- росателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 кб 4) 0и MLS1 (на расстоянии 150 кб) - проксимальные. Изучены особенности ал- лельного полиморфизма этих систем для различных популяций
Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих мик- росателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывет их весьма близкое располо- жение на генетической карте по отношению к мутантному гену
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
