Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция и исследование мРНК, искусственные транскрипционные системы.
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В соответствии с этим исследования дифференциальной активности генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и изучение соответствующего белкового продукта, включая его процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка- неспецифическое распределение .
Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге- нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю- щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку- лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов проводят с использованием разнообразных современных методов молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в
5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци- фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы путем исследования транскрипции в различных линиях клеток при введении в них генов с искусственными делециями этих участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу- ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы- ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в составе векторных последовательностей вводят в культивируе- мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло- рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест- венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.
Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя- ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в клетке, но и с высокой точностью проводить количественную оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи- мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди- фицированы таким образом, что в них после трансфекции про- исходит амплификация копий сконструированных определенным образом эписом (внехромосомных генетических конструк- ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг- налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов
(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга- низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных манипуляций трансгенные животные могут быть также использо- ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов тканеспецифической активации генов in vivo.
Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли- руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от
0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко- чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ
РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтети- ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо- вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли- бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме- тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде- лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,
Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика- цию среди них специфических молекул путем использования раз- личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты
(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоп- лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про- водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб- ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон- центрированных и фракционированных путем электрофореза моле- кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последова- тельности, что позволяет точно определить размер РНК транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо- мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри- дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо- лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.
Кроме того, характер электрофоретического разделения позво- ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях, когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную
РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра- цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со- держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление
A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб- ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп- лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана- лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования интронов.
Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети- ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек- тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа- да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди- намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино- мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип- цию.
Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер- вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием искусственным образом сконструированных транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;
Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три- фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради- оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово- дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее описанных методов анализа мРНК, используют немеченые кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим достоинством этой транскрипционной системы является ее максимальная приближенность к естественным процессам. При втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен- тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и регуляторных белков.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе- мы.
Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттрансляционных модификаций белков основаны на использо- вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати- ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер- жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино- кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав- ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова- ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами, при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако, для значительного числа моногенных наследственных заболева- ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова- тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими- ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от- носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу- ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством анализа структуры, функции и синтеза белков
(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно- ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь- ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива- ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин- женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч- но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге- нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.
Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль- ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и их используют, обычно, для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе- ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь- ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му- тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи- мости различных участков белка.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
