Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз- вестного наследственного признака (гена) в значительной сте- пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке- ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи- ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока- лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли- морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети- ческих маркеров производят по результатам совместного анали- за их сегрегации в информативных семьях.
Значительные успехи в геномном картировании были связа- ны с использованием в качестве генетических маркеров широко распространенной во многих популяциях изменчивости по изо- ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.
Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются по специфической активности, но имеют измененную электрофо- ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко- вых систем, контролируемых разными генами, локализованными во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти- фицированы соответствующие группы сцепления.
Совершенствование молекулярных методов анализа специфи- ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо- го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай- тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы- ла использована для маркировки участков хромосом с целью установления более точного взаиморасположения локусов. Вско- ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10 до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро- мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно для определения хромосомной принадлежности генов, от- ветственных за любой тип наследственной изменчивости
(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин- дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех известных генов на основании анализа сегрегации соответству- ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре- деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав- номерно распределенных полиморфных маркеров.
Идентификация в геноме человека большого числа поли- морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана- лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно повысили возможности локализации неизвестных признаков на геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000 клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли- морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ- ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи- ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени это анонимные последовательности, связь которых со специфи- ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло- на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая номенклатура для обозначения используемых в качестве марке- ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D, что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль- ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но- мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.
Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге- нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ- кая информативность (частота гетерозигот не может превышает
50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение
ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли- шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа- тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК последовательностей в качестве индексных генетических марке- ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че- ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо- лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно распределенных по хромосомам практически завершенаа
(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.
(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю- чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при- мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более
90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте- ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В
1992г. группе французских ученых под руководством Жана
Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по- мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации
(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из
814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя- нием между ними около 5 сМ, получившую название
Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000 фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру- жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.
Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000
(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле- дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по- лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден- тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со- держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге- нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90% всего генома человека.
К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до
2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти- вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста- ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру- ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих весь геном человека со средним расстоянием между соседними маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из
Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни- ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по- лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР), причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково- го молекулярного веса можно было различить на электрофорег- рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9
STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо- ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.
Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.
Только с помощью одного автоматического сканнера удается проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва- ет самые широкие возможности не только для генетического картирования и создания подробных карт сцепления практически любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно, она делает реальной разработку стратегии картирования генов, мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо- леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда, психозы и многое другое.
Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов, пульсирующий гель-электрофорез.
Используя столь обширную систему молекулярных маркеров и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур или на материале информативных родословных можно довольно быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп- ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не- посредственно к позиционному клонированию с целью выделения и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш- ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро- мосом и их фрагментов.
Точность цитогенетического картирования определяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо- вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти- рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен- том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1 миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50 тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее, даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар- тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы- чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.
Значительно более точные результаты достигаются на 2-м этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.
Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.
Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети- ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление этих типов физических карт практически невозможно.
Одним из способов преодоления этих трудностей является конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги- бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме- ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото- рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб- лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.
Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен- ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото- рых механически, под контролем микроманипулятора может быть вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.
Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз- мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти- дов (Estivill, Williamson, 1987).
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую- щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith et al., 1987). В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде- лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
