(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли- нических испытаний должны включать следующие разделы: обос- нование выбора нозологии для проведения курса генной тера- пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди- фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс- генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co- hen-Haguenauer, 1995).
Важнейшим элементом в программе генной терапии является анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово- дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу- ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.
Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по- мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии введенных генов путем идентификации и количественной оценки соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по- лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме- дицинского обследования и вносят необходимые исправления и добавления в проводимую схему лечения.
Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы- бор клеток-мишеней.
Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе построения программ генной терапии. Итак, генная терапия предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише- ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па- тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст- ранению патологических процессов. В первом случае, в орга- низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева- ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены, обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству- ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ- фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель- но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом, в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге- нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции могут служить самые разные соматические клетки, как несущие дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера- певтические свойства после трансфекции. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те- рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи- вирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин- фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время большинство допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии использует именно этот подход (Cul- ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в крупных специализированных центрах, требует больших матери- альных затрат и высоких биотехнологий.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло- нированных и определенным образом упакованных последователь- ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые
ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь- ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен- но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс- таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе- мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта- ми генетической модификации являются специфические типы ле- гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут использоваться для модификации различных типов клеток и со временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и универсальным способом доставки чужеродного генетического материала в любые ткани.
Эффективность курса генной терапии в значительной сте- пени зависит от правильного выбора типов соматических кле- ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика- ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге- нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю- бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан- ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует- ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи- ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер- вичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового про- дукта, а также биохимический анализ патологического процес- са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую- щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти- ческих вмешательств определяется также доступностью кле- ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга- низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле- ток, длительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность гене- тической модификации не самих уже дифференцированных клеток с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые при создании определенных микроусловий могут дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи предложенный недавно эффективный метод получения стволовых клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).
Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене- тической модификации, завершается оценкой результатов пере- носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба- цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про- водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари- тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет- ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и его коррекции на биохимическом уровне.
Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия- ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи- модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор- ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi- vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли- чество синтезированного белка, необходимое для нормализации биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от- вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.
Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про- верка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Показатели длительности и характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров для оценки необходимой периодичности повторения терапевти- ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже- родного гена и опасность вирусной контаминации в результате использования компетентного по репликации вектора (см.ниже), могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соот- ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу
VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи- вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли- нических испытаний.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те- рапии.
Решающим условием успешной генотерапии является обеспе- чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто- ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель- ной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси- рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями, белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE - декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота), либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли- шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис- тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва- ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи- мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес- пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос- новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя- ются на химические, физические и биологические. Эффектив- ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро- ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в
ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.
Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек- ции in vitro (Culver, 1994).
--------------------T------------T-------------T------------¬
¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦
¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦
¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦
¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
