МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ-
НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг- ностики.
Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос- тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос- тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо- лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций.
Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике, которая может быть проведена с использованием молекулярных методов анализа на самых ранних стадиях развития плода
(см.7.5). Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет вы- работать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носите- лей в семьях высокого риска, что является важным фактором профилактики наследственных болезней. Решающими преимущест- вами молекулярной диагностики являются её универсальность, возможность использовать для анализа любые ДН-содержащие клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на лю- бых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагнос- тику мононогенных наследственных болезней. В общем случае, использование прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с известной нуклеотидной последователь- ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари- тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв- ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко- торых и составляет основную задачу исследования. Такой под- ход особенно эффективен при наличии точной информации о при- роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми- нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна, мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес- ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру- гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме- тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций, подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци- доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести- ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.
При этом появляется реальная возможность выявлять свыше
95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко- номически оправданным скринирование всей популяции отдельных стран на выявление мутантных особей для последующей органи- зации эффективных профилактических мероприятий, направленных на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад- ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме- рики.
Главное преимущество прямого метода - это высокая, до- ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи- мости анализа всей семьи на предмет её информативности
(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про- ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен- на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме- дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис- ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо- вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov et al., 1992).
Однако, существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма- жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи- саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег- да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест- ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид- ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых
(косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на исполь- зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то есть у родителей больного и его ближайших родственников. В настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных забо- леваний с известной локализацией контролирующего гена, для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).
Более того, косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти- фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик- ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние иследования непрямым методом проводились почти исключительно с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель- ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%, а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя- ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова- тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи- телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно- го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае
ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ- ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали- зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг- ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион- ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Все эти недостатки могут быть устранены при использова- нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан- демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов
(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро- вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.
Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось
(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге- нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук- леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование, практически, любого картированного гена. Особенную диагнос- тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко- торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди- агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля- ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго- щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их применение позволяет маркировать, то есть сделать информа- тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос- тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма- териала .
Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке- ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел
7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны- ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка- честве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали- зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите- лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му- тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по- мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР
(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто- ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).
Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле- дования.
Напомним, что значительное число моногенных заболеваний наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто- сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо- зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы, но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли- тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни- женные потенции к размножению, редко удается выявить больных родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который возникает либо за счет высокой частоты близкородственных браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых изолированных популяций ограниченной численности. Больные дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро- дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та- кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто- рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред- шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе риска относительно невелика, а риск повторного рождения в них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен- ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в
Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль- чики, тогда как носителями являются девочки.
Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто- сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко- ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо- сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо- ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе- ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо- нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре- версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
