Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол- ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо на введение в организм больного соответствующей кДНК, обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу- ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо- левания находится на стадии экспериментальных разработок

(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив- ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель- ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож- ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты, гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап- равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач- нутся уже в ближайшем будущем.

10.4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван- ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок

(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо- лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак- тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по- липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се- риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак- тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль- ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо- ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо- кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.

Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни- кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо- лированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав- ляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге- мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти- дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы- раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети- лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота

G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии

(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание

(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи- лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен- ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо- торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана

Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз- расту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.

Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия B была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных за- болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген- ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв- ляется составление национальных баз данных молекулярных де- фектов и специфических методов их диагностики. В частности, основываясь на подобной информации, авторы провели характе- ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией B шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно- вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли- фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко- вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш- ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве- дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы- шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком- бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер- тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич- ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа- листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи- лии В - событие самого ближайшего будущего.

10.4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото- рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору

VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру- ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.

Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу- дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде- ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син- теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак- тора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент- рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.

Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре- цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив- ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора

VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско- рости их выведения из плазмы (тип IIB).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи- на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000 пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица

VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после- довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб, соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,

1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му- тации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,

1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе

IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар- ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег- менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.

При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи- лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма- лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру- ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую- щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС

(Mazurier, 1992).

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо- левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.

Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози- готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци- тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута- ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон

Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов- ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо- лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра- вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг- ностики и результатами медико-генетического консультирова- ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле- дования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно, а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа- ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве- ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49