Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу- ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова- ния с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва- ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает особенно широкие возможности для применения метода прямого секвенирования.
Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг- ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред- ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон- центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве- нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо- чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при- шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин - стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси- руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова- тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме- ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера- зы. После амплификации в системе in vitro проводят транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра- зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования
- метод GAWTS (genome amplification with transcript sequences).
Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель- ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду физических и химических характеристик, которые в значительной степени варьируют в зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под- черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак- тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле- ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек- венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из- вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред- варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре- зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот- кие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли- ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про- тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы- явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри- дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп- ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз- личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе- рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни- ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе
(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден- тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо- дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю- шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро- ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок- рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег- рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам- плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от- дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали- зацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции, находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова- тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика- ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле- ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика- ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу- ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо- лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб- раны последовательности из этих областей гена, только му- тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь- шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо- нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.
Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь- зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали- чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му- ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле- ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест- рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре- деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после- довательности по сравнению с нормальной.
При мутациях гена, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен- тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими- ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри- мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор- мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше- ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо- бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду- щими из этих методов являются: метод анализа конформационно- го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра- диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп- ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно- го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования
Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3
Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер- вичной идентификации мутаций.
-------T---------T--------T------------T----------------¬
¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦
¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+
¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+---------+--------+------------+---------+------+
¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦
¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦
¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦
L------+---------+--------+------------+---------+-------
"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и кДНК
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред- ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности одно- нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа- ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост- ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи- ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра- зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек- рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово- дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения
ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT
Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се- ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы - температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов
(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз- воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обна- руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме- тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь- ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ- ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди- намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж- ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра- диент денатурации достигается разницей температур, различной концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру- ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю- щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле- отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату- рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквива- лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу- ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля- ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле- кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
