ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра- зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре- зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб- ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан- тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь- тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали- зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло по- темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения, отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова- нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде- ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова- ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа- ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике, однако, определение нуклеотидной последовательности протя- женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за- дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими- ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование - метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно- го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури- руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго- нуклеотидную последовательность, комплементарную определен- ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб- ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы- рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов
- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю- щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато- ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети- ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до- рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит и определена локализация ди- дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность все- го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет назад оценивалась в 1$.
В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред- варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро- ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока- залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль- шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа- лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси- нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот- ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение в реализации программы Геном человека. По последним данным, разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив- ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож- но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.
В последние годы активно разрабатываются принципиально новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова- ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля- ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы- ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо- да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе- рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре- деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру- емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на- бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле- дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок- тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет автоматизации процесса.
1.7 Полимеразная цепная реакция.
До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони- рование являлись единственными способами поиска и выделения специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей
ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи- альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш- ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так как определяются наличием соответствующих рестрикционных сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе- ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК
(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока- зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед- ленного использования собранной крови для выделения ДНК или хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова- ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи- вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент- ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не- обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив- ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны быть использованы в течение очень короткого периода после их приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали- чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не- обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд- линяет время получения результатов, что также ограничивает использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди- агностики плода, специфика которой во многом определяется сроком беременности.
Предложенный в 1983г. американским исследователем
Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте- зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.
Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук- леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро- ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями
ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'- концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка- честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип
ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери- альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермен- та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по- тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,
1987).
Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока- зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг- ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю- щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав- шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50
С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе- ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С, начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух- нитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за- тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку- лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу- чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро- ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
