(Romeo, McKusick, 1994). Для каждого заболевания из подобной серии аллелизм мутаций уже доказан на молекулярном уровне.
Причины подобного фенотипического разнообразия могут быть различными: (1) локализация мутантных аллелей в функциональ- но разных доменах белка; (2) принципиально разный механизм действия мутаций (loss-of-function, gain-of-function); (3) присутствие в том же гене модифицирующего мутантного аллеля или полиморфизма и (4) влияние генетического окружения на проявление мутантного аллеля, то есть его взаимодействие с определенными аллелями гена-модификатора или даже нескольки- ми такими генами. Углубленный молекулярно-генетический ана- лиз практически каждого наследственного заболевания указыва- ет на его значительную генетическую гетерогенность, связан- ную с различными мутациями гена. Некоторые примеры аллельных серий и генетической гетерогенности заболеваний будут рассмотрены более подробно в Главе X.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Для практических целей и, главным образом, для чтения научной литературы, важно знать, как записываются мутации.
До недавнего времени единой номенклатуры записи мутаций не существовало. В 1992 г. двумя американскими учеными Артуром
Боде и Лап-Чи Тсуи была предложена универсальная стандартная система для обозначения разных мутаций (Beudet, Lap-Сhee
Tsui, 1993). Она рассчитана как на запись аминокислотных за- мен в белках, так и на нуклеотидные замены и перестановки в
ДНК. В первом случае, каждой аминокислоте соответствует од- нобуквенный символ (Табл.4.1), слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа - мутантный, а расположенный в центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного продукта трансляции. Например, запись D44G означает замену аспарагина на глицин в 44-м положении полипептидной цепи, а
A655E - аланина на глутамин в пложении 655 белкового продук- та. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Буквой Х обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например,
Q39X означает замену глицина на стоп сигнал в 39-м кодоне, а
W1282X - триптофан-триплета на стоп-кодон в положении 1282.
Отсутвие одной или нескольких аминокислот обозначают значком
^-дельта. Так, наиболее частая мутация, приводящая к муко- висцидозу- ^F508 - означает отсутствие фенилаланина в 508 положении трансмембранного регуляторного белка муковисцидо- за. Полиморфизмы, связанные с равноценной по функциональной значимости заменой аминокислот, записывают через черточку.
Например, M/V470 - метионин или валин в положении 470.
Таблица 4.1. Символы аминокмслот.
------------------------T-----------------T--------------¬
¦ Аминокислоты 1¦ 0 Трехбуквенный 1¦ 0 Однобуквенный 1¦
¦ 1¦ 0 символ 1¦ 0 символ 1 ¦
+-----------------------+-----------------+--------------+
¦ Аланин 1¦ 0 Ala 1¦ 0 A 1 ¦
¦ Аргинин 1¦ 0 Arg 1¦ 0 R 1 ¦
¦ Аспарагин 1¦ 0 Asn 1¦ 0 N 1 ¦
¦ Аспарагиновая кислота 1¦ 0 Asp 1¦ 0 D 1 ¦
¦ Asn и/или Asp 1¦ 0 Asx 1¦ 0 B 1 ¦
¦ Цистеин 1¦ 0 Cys 1¦ 0 C 1 ¦
¦ Глутамин 1¦ 0 Gln 1¦ 0 Q 1 ¦
¦ Глутаминовая кислота 1¦ 0 Glu 1¦ 0 E 1 ¦
¦ Gln и/или Glu 1¦ 0 Glx 1¦ 0 Z 1 ¦
¦ Глицин 1¦ 0 Gly 1¦ 0 G 1 ¦
¦ Гистидин 1¦ 0 His 1¦ 0 H 1 ¦
¦ Изолейцин 1¦ 0 Ile 1¦ 0 I 1 ¦
¦ Лейцин 1¦ 0 Leu 1¦ 0 L 1 ¦
¦ Лизин 1¦ 0 Lys 1¦ 0 K 1 ¦
¦ Метионин 1¦ 0 Met 1¦ 0 M 1 ¦
¦ Фенилаланин 1¦ 0 Phe 1¦ 0 F 1 ¦
¦ Пролин 1¦ 0 Pro 1¦ 0 P 1 ¦
¦ Серин 1¦ 0 Ser 1¦ 0 S 1 ¦
¦ Треонин 1¦ 0 Thr 1¦ 0 T 1 ¦
¦ Триптофан 1¦ 0 Trp 1¦ 0 W 1 ¦
¦ Тирозин 1¦ 0 Tyr 1¦ 0 Y 1 ¦
¦ Валин 1¦ 0 Val 1¦ 0 V 1 ¦
L-----------------------+-----------------+---------------
Принципиальная схема записи и нумерации нуклеотидов приведена на Рис.4.1. Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК на- чинается с первого смыслового кодона, так что нуклеотид под номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК.
Вверх по течению (или справа налево от 3' к 5'-концу) от первого кодона нуклеотиды записывают со знаком "-", вниз по течению (от 5 'к 3') - со знаком "+". Для многих генов отсутствие точных данных о положении инициирующего сайта и наличие нескольких мест инициации транскрипции существенно затрудняют нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозна- чают заглавными буквами, интронов - прописными.
В Табл.4.2. даны примеры обозначения различных мутаций с использованием как аминокислотной, так и нуклеотидной ну- мерации. Нуклеотидная система записи особенно важна для обозначения делеций, инсерций, сплайсинговых мутаций и поли- морфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происхо- дящими в нетранслируемых частях гена. В случае делеции или инсерции одного или двух нуклеотидов приводится их буквенное обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начи- ная с 852-го нуклеотида, а 3320ins7 обозначает вставку 7 пар оснований после нуклеотида 3320. В случае больших вставок или делеций их размеры указыаются в килобазах, например
2115ins13kb, или обозначаются соответствующие инсертирован- ные/ делетированные структурные элементы генома. Так,
2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида
2115. При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нук- леотидов (со знаком "+" в случае 3' конца экзона и со знаком
"-" в случае 5' конца) и характер нуклеотидной замены.
(Рис.4.1, Таб.4.2). Например, 711+5G-T обозначает замену G на Т в 5-м основании интрона, следующего за экзоном, закан- чивающимся 711 нуклеотидом.
Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му- тантных ДНК.
Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым прямым методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции, дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb, затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани- ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль- шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута при работе на специальным образом приготовленных (растяну- тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри- дизации in situ (FISH - Глава II).
Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов, могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях гене- тического анализа, предшествующих молекулярному клонированию гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяжен- ные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации, локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием ре- ализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мута- ций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью ге- на, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной
ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную
ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепя- щими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибриди- зации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (Глава I) и проводят сравнительный анализ расположения бэндов на ради- оавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рест- риктазы Msp1 и Taq1, которые узнают сайты CGGG и TGGA, соот- ветственно. Благодаря наличию СpG последовательностей эти сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию
(см.раздел 4.5). Наличие протяженных делеций, либо точечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других то- чечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и неболь- ших структурных аномалий возможен только для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основа- ны, главным образом, на использовании полимеразной цепной реакции в её различных модификациях (см.Главу I, а также разделы 4.5 и 4.6).
Для анализа мутантных аллелей, прежде всего, необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, ко- торые могут быть получены либо путем клонирования или ампли- фикации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплифи- кации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК паци- ентов (Рис. 4.2). В первом случае отбирают клонированные к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг кДНК-овых библиотек, сконструированных из специфических тка- ней или культур клеток больного. При этом в качестве зондов используют кДНК-овые последовательности нормального гена.
Другим источником кодирующих последовательностей мутантного гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем специфической амплификации перекрывающихся последователь- ностей кодирующих областей гена, используя в качестве матри- цы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изо- лированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то, что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей, нуклеотидные последовательности которых, как правило, стано- вятся известны вскоре после идентификации и клонирования ге- на. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в свя- зи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Од- нако, обнаружение следовых количеств, так называемой, неза- конной или эктопической мРНК во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови, позволяет преодалевать и эти трудности (Kaplan et al., 1992). Успех подобной процедуры получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разра- боткой эффективных методов выделения и обратной транскрипции мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях
(например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна
(см.Главу X). Единственным принципиальным ограничением мето- дов детекции мутаций в кДНК-овых последовательностях явля- ются невозможность выявления мутаций в регуляторных и инт- ронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены только при анализе геномной ДНК пациента.
Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет сложностей, так как она может быть изолирована из любых кле- ток или тканей больного независимо от характера экспрессии исследуемого гена. Однако, амплификация целых экзонов воз- можна только при знании нуклеотидных последовательностей фланкирующих интронных областей, из которых и производят подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог- раничениям этого подхода следует отнести необходимость достаточно полной информации о структуре гена и о его пер- вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области гена, отсюда для получения более полной информации необходи- ма амплификация многих экзонов.
Стратегия идентификации мутаций может быть различной и, в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини- рование уже известных мутаций. В первом случае обектом исследования чаще всего служат клонированные или амплифици- рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку- лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи- руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
