На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо моногенного наследственного заболевания руководствуются сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста- точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока- зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из- менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу- ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели наследственных болезней известны и достаточно полно изучены для многих других экспериментальных и домашних животных.
Представляется удивительным, что, несмотря на большое сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич- ной структуре и тождественных по функциям структурных генов, для значительной части наследственных болезней человека ге- нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко- нюхов, 1969).
Это ограничение в настоящее время может быть преодалено путем целенаправленного конструирования генетических модель- ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;
Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо- вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет- ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати- ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге- нов in vivo и оценки их биологического действия особенно удобными оказались трансгенные животные.
Раздел 8.2. Трансгенные животные.
Трансгенных животных получают в результате искусствен- ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате- риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после- довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекуляр- но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже- родного гена, оценки его биологического действия на орга- низм, а также для производства различных манипуляций со спе- цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь- ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо- лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля- ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло- дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик- романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек- летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб- ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка- кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.
При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ- ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег- рация может происходить в разные хромсомные сайты и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна- чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти- руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по- добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.
Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис- пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес- сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи- ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз- личных тканях трансгенного животного.
Другой, более более прогрессивный способ получения трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер- гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи- мущества в плане генетического моделирования подробно рассмотрены в разделе 8.4.
Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро- мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко- пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.
После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети- ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по- томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве- денной ДНК в функционально значимые области генома может приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом, животные, полученные при введении одного и того же гена, бу- дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест- ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях, по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.
Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле уникально.
Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь- ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен- ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об- наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова- тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче- тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой фер- ментативной активности. Использование для трансгеноза реком- бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби- нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос- тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз- мов активации генов в разных типах тканей.
Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже- родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк- лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с уже известными наследственными нарушениями у человека и по- добные животные также могут использоваться в качестве гене- тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре- нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи- ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо- вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно
(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до- полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше- нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс- твие этого, было причиной патологических процессов.
Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
Другой вариант биологического моделирования основан на получении животных с определенными очень специфичными, но ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько примеров подобного экспериментального моделирования.
Описанная технология трансгеноза (введение генов в про- нуклеус) может быть использована, в частности, для направ- ленного получения животных с избирательными дефектами
(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает- ся в возможности селективной элиминации тех специфических типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа- щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий- ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде- ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива- ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз- вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая система действует как очень точный скальпель.
Дальнейшая модификация метода заключается в использова- нии для трансгеноза условно летального гена, каким является, например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки, экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль- но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик- ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль- ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи- ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так- же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью этих клеток. Подобная методология используется также при разработке генотерапевтических подходов для лечения некото- рых ненаследственных, в частности онкологических заболева- ний (см Главу IX).
Весьма многообещающим методом моделирования представля- ется направленное выключение работы определенных генов путем введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.
Такой подход был применен, в частности, при попытке модели- рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен- ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).
Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля- ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.
Другой пример экспериментального моделирования основан на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор- жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у таких животных может происходить дифференцировка трансплан- тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе- ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека, имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк- туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак- тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан- тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф- фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители- альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не- сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по- добных моделей и возможность генетического манипулирования с клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела- ют этот подход весьма привлекательным для решения многих экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде- лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи- вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
