95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута- ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом применен также для анализа индуцированных мутаций, так как позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од- ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме- тода следует отнести техническую сложность получения равно- мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных

GC-концов.

HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз- воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля- ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы- ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо- логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.

Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута- ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в том, что при амплификации относительно небольших фрагментов генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич- ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти- пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль- ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле- кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав- нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под- вижности) за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри- ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо- и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах

ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу- ществляется как изотопным, так и неизотопными методами

(Grompe, 1993).

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.

Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.

Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды, клонированные последовательности ДНК или амплифицированные фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).

При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме- шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо- вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах

ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. После обработки соответствующими химическими агентами идентификация и лока- лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово- дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко- роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео- бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен- тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода

CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций

(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:

(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики. К числу недостат- ков можно отнести высокую токсичность используемых хими- ческих реактивов. Последняя может быть частично ослаблена использованием карбодиимида для идентификации GT гетеродуп- лексов.

Весьма близким по принципу к CMC- методу является метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью созда- ются условия для образования гетеродуплексов между тестируе- мой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченой РНК про- бой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул

РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных мутаций определяются как и в случае СМС, по размерам образо- вавшихся фрагментов после электрофореза и авторадиграфии.

Необходимость использования радиоактивно меченой РНК- пробы и возможность детекции только около 50% точечных мутаций ли- митируют широкое применение метода (Grompe, 1993).

Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена путем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего полипептидного продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, ампли- фицировуют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраи- вают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содер- жащих большое число экзонов, таких как ген миопатии Дюшенна или ген нейрофиброматоза 1.

Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.

Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предпола- гают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практи- ческой диагностике и при популяционном скрининге гетерози- гот. После описания мутации появляется возможность ее анали- за более простыми способами, не требующими секвенирования.

Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифициро- ванных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.

Из миссенс мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или об- разованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз.

Они выявляются по изменению длины амплифицированного фраг- мента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.

Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компь- ютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализа- ции замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5 - 6 нуклеотидов.

Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза ( Ng et al., 1991; Eiken et al.,1991). Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосред- ственно примыкал к мутантному сайту (Рис.4.8). Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем из- меняют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эн- донуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих дан- ную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два до- полнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрициро- ванным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.

Концептуально близким к этому варианту является метод получивший название "амплификация рефрактерной мутационной системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме- разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия

(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп- раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи- ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова- тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай- мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли- гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен- ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо- ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим из которых является концентрация ионов магния в растворе, наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай- мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на- личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо- вательность, тогда как при использовании нормального олиго- нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на- шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону- рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов

HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо- ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом является возможность применения полностью автоматического сканирования.

Таким же преимуществом обладают и методы детекции состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли- гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).

При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после- довательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид- ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под- бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар- ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на- личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не- посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер- минального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги- рования и при определенных условиях проведения реакции сшив- ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также лигированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49