Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле- копитающих и современные достижения молекулярной генетики позволяют осуществлять направленное получение генетических моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи- ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо- жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани- пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно важными в этом отношении оказались два новых методических подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио- нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло- нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно- ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек- ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности
ДНК в месте встраивания.
Конструированию генетических моделей должны предшество- вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич- ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото- рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес- кими возможностями экспериментального манипулирования с жи- вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова- ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб- риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби- нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от- бором клонов со специфическими генетическими модификациями;
(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи- мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не- сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;
(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7) инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).
Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ- ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб- риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;
Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле- точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос- тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф- ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель
(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо- гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио- нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре- зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ- ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч- ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза- висимым образом полученные в результате введения в одинако- вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе- редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую- ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс- миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по- томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти- пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис- кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан- ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.
Возможность вести селекцию нужных мутантных или трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка- честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети- ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра- батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби- рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.
Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни- хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы
(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети- ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ- фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло- гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби- нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин- теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо- жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе- циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной
ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной
ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со- общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418, содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток будут в этих условиях деградировать.
Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
Наиболее важным шагом на пути искусственного получения мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако, случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не- которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело- века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые направленная сайт-специфическая модификация была выполнена также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше) и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру- ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че- ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо- ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.
При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер- цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи- цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).
В настоящее время предложено несколько вариантов для направленного переноса неселектируемых генов за счет допол- нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес- сия происходит преимущественно при правильном встраивании векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так, маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться только находясь под контролем какого-либо другого промотора хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.
При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет
Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо- логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На этом же принципе основано использование генетических конс- трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза- ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос- ледовательности, расположенный вне направленно переносимого участка экзогенной ДНК.
Особенно перспективным на сегоднешний день представля- ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме- тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.
Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина- ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо- герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги- белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу
(Рис.8.3).
Отбор клеток с модифицированным геном также может про- изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло- гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди- фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе- мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди
50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг- нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей, наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле- точных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техни- ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо- вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише- ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
