HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич- ная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертиро- ванный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT ми- ни-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в ко- торый предварительно вносят интересующие исследователя мута- ции. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие
ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирую- щий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроен- ной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с по- мощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные, заранее спланированные изменения, в том числе и специфичес- кие мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить более тонкое генетическое моделирование и исследовать осо- бенности функции мутантного гена in vivo.
Для введения специфических мутаций в определенные экзо- ны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Has- ty et al., 1991). Перспективным также представляется исполь- зование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомоло- гичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие конструкции легко вводить специфические мутации и затем ис- пользовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных животных 4.
Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых произошла направленная модификация гена-мишени, в значитель- ной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие этапы этой программы, включающие получение химерных транс- генных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров
(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах осо- бей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложня- ющим обстоятельством является то, что химерные животные не- редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант- ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена- тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем отбора и скрещивания гетерозигот.
Несмотря на огромные методические сложности и высокую стоимость, направленное получение моделей наследственных бо- лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло- гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на- рушений работы определенного гена, анализировать влияние специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс- твенные препараты и испытывать различные терапевтические подходы. Велика также роль генетических линий в разработке методов генной терапии (см. Главу IX).
ГЛАВА IY.
ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му- таций.
Каждый генетический локус характеризуется определенным уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.
Применительно к гену, аллели разделяются на две группы - нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге- на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, независимо от их локализации и влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие мутации является более широким по сравнению с понятием му- тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва- рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му- тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.
Как упоминалось ранее, различные изменения в нуклеотид- ной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает никакого влияния на структуру и функцию соответствующего белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приво- дящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетическо- го кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть под- разделены на три класса: (1) мутации, ведущие к полной поте- ре функции (loss-of-function), (2) мутации, сопровождающиеся количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных белковых продуктов и (3) доминантно-негативные мутации, из- меняющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они оказывают повреждающий эффект на жизнеспособность или функ- ционирование экспрессирующих типов клеток (gain-of-function мутации). Наибольшим повреждающим действием обладают мута- ции, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, ли- бо к преждевременному окончанию его синтеза, то есть делеции или инсерции, не кратные трем нуклеотидам и потому вызываю- щие сдвиг рамки считывания, а также нонсенс мутации - замены нуклеотидов, при которых образуются терминирующие стоп-кодо- ны. Проявление таких мутаций зависит от их внутригенной ло- кализации. Чем ближе мутации к 5' концу гена, то есть к на- чалу транскрипции, тем короче их белковые продукты. Такие абортивные (truncated) белки неспособны к модификациям и быстро деградируют.
Фенотипическое проявление замен нуклеотидов в кодо- нах, так нназываемых миссенс мутаций, зависит от природы соответствующих аминокислотных замен в белке и от функцио- нальной значимости того домена, в котором это произошло.
Так, замены аминокислот в активных центрах белков могут соп- ровождаться полной потерей его функциональной активности, тогда как даже значительно более серьезные нарушения в дру- гих частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние на фенотип. Мутации на стыке экзонов и интронов (так называ- емые сплайсинговые мутации) часто нарушают процессинг пер- вичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, ли- бо вырезание экзонов и образование делетированного белка. В обоих случаях сплайсинговые мутации, как правило , обуслав- ливают тяжелое течение болезни. Нарушения в регуляторных об- ластях генов сопровождаются количественными изменениями соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функ- циональной активности белка. Проявление таких мутаций опре- деляется, в конечном счете, пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило, регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выра- женным плейотропным (множественым) эффектом по сравнению с мутациями структурных генов.
Относительно недавно выявлен новый класс так называемых динамических мутаций, или мутаций экспансии, связанных с нестабильностью числа тринуклеотидных повторов в функцио- нально значимых частях генов. Многие тринуклеотидные повто- ры, локализованные в транскрибируемых или регуляторных об- ластях генов, характеризуются высоким уровнем популяционной изменчивости, в пределах которого не наблюдается фенотипи- ческих нарушений (Willems,1994). Болезнь развивается лишь тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит опре- деленный критический уровень. Наследование таких мутаций, как правило, отличается от классического Менделевского ти- па. Для них характерны: различная пенетрантность в сочетании с неполным доминированием; геномный импринтинг (различия фе- нотипических проявлений в зависимости от того, получена му- тация от матери или от отца) и феномен антиципации - на- растание тяжести проявления заболевания в последующих поко- лениях (Willems,1994).
Классическим примером мутаций экспансии является синд- ром ломкой Х-хромосомы (FraXA), обусловленный присутствием удлиненных CCG повторов в 5'-нетранслируемой регуляторной области FMR1-гена (Xq27.3). Аналогичные нестабильные повторы обнаружены еще в трех ломких сайтах, причем два из них
(FraXE и FraXF) расположены на очень небольшом расстоянии дистальнее FraXA. Во всех четырех случаях CCG-повторы лока- лизованы вблизи от CpG островков, при этом увеличение числа копий триплетов выше определенного порогового уровня сопро- вождается гиперметилированием всей регуляторной GC-богатой области, вследствие чего и происходит резкое снижение и полное выключение транскрипционной активности - мутации по типу " утраты функции" (loss-of-functions). Таким образом, область CCG-повторов в этих локусах можно рассматривать, как своеобразный cis-действующий элемент транскрипции (Willems,
1994, Mandel,1994).
Другой тип динамических мутаций описан для 6-ти раз- личных тяжелых аутосомно-доминантных нейродегенеративных расстройств (см. Главу X). Для всех этих заболеваний обнару- жено присутствие удлиненных CAG-повторов в открытой рамке считывания (ORF). Эти повторы транслируются в протяженные полиглютаминовые треки, предположительно локализованные в
ДНК- связывающих доменах соответствующих белковых продуктов.
В результате белковые молекулы приобретают новые свойства, нарушающие нормальные метаболические связи. Таким образом, нестабильные CAG-повторы можно рассматривать, как gain-of-function - мутации. Интенсивно обсуждается также возможность участия амплификации CAG-повторов в формировании предрасположенности к таким частым расстройствам центральной нервной системы, как шизофрения и маниакально-депрессивный психоз. Примером третьей группы болезней экспансии служит миотоническая дистрофия. При этом заболевании огромные CTG
(или CAG) повторы локализованы в 3'-нетранслируемой области гена. Они также рассматриваются, как факторы, нарушающие нуклеосомную организацию гена и подавляющие его транскрипцию
Более подробно болезни экспансии рассмотрены в Главе X.
Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных заболеваний.
Одним из важных обобщающих итогов молекулярно-генети- ческих исследований моногенных болезней явилось доказа- тельство их генетической гетерогенности. Последняя может быть вызвана разными причинами. Прежде всего, оказалось, что один и тот же биохимический эффект (фенотип) может быть обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, мута- ции одного и того же гена, как установлено, могут приводить к совершенно разным клиническим проявлениям. Например, мута- ции гена адренорецептора, сцепленого с Х-хромосомой, могут быть причиной нейродегенеративного заболевания - болезни
Кеннеди, если они захватывают область тринуклеотидных повто- ров (Глава X), и в то же время приводить к синдрому тестику- лярной феминизации, то есть нарушениям половой дифференци- ровки, если они затрагивают другие последовательности этого же гена. Крайним выражением такой гетерогенности может слу- жить пример с геном рецептора тирозинкиназы -RET, различные мутации которого могут приводить к 4-м совершенно различным наследственным синдромам, таким как семейная медуллярная карцинома щитовидной железы, болезнь Гиршпрунга, множествен- ная эндокринная неоплазия тип 2А (МЭН-2А) и тип 2B (МЭН-2B)
(Hayningen,1994). Подобные фенотипические разнообразия про- явлений мутаций одного и того же гена получили название ал- лельных серий. Термин используется уже около 20 лет для описания групп из нескольких моногенных наследственных забо- леваний, клинические проявления которых позволяют предпола- гать их связь с разными генами, в то время как биохимические и/или генетические исследования доказывают их аллельную при- роду, то есть в основе их патогенеза лежат разные мутации одного и того же гена.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
