Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме- ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля- ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст- вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каж- дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно, составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи- цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров, длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич- ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и состав амплификационной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.
С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особен- ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици- руемого участка. Разработаны различные варианты автомати- ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото- рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри- дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со- держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме- чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли- чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг- леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен- ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль- туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге- нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен- ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши- еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде специальных руководств и инструкций.
Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь- зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплифи- катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа- щих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич- ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации, продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров, то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в первом раунде участка ДНК.
В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат- ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас- луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.
На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить, что реакцию амплификации можно проводить не только в раство- рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар- ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи- кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо- вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра- зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ- ального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ- но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР, так как этот метод по праву стал один из основных в молеку- лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;
Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).
Возможность очень точного и специфичного выбора участ- ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо- лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку- лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную
ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле- те в виде красной полосы после электрофоретического концент- рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.
Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.
При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках
ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли- чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат- ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и му- тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на- конец, возможно определение полной нуклеотидной последова- тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му- таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму- щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна- чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью
ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу- тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.
Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова- ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству- ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо- ванием ПЦР.
ГЛАВА VI.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото- рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда- ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге- нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо- вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции активности генов в нормальных клетках, оценку клинического выражения различных типов нарушений гена, выявление первич- ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку- лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.
Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо- зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе- чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че- ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках печени - основной биохимической лаборатории организма - око- ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,
1977). Это означает, что в различных соматических клетках эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,
1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо- дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про- цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях организма происходит избирательная активация многих других специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско- рости их синтеза.
Контроль генной активности осуществляется за счет диф- ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд- рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным результатом которой является синтез функционально активного белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной активности, но и полноценность всех последующих этапов, включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре- шающее значение для успешного анализа всего этого сложного комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по- иск и целенаправленное конструирование которых представляет вполне самостоятельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло- нирования, генноинженерного манипулирования, направленного введения сайт специфических мутаций, получения большого ко- личества клонированных последовательностей ДНК, специфи- ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно используют генетически хорошо изученные прокариотические системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут- риклеточной локализации и функционирования чаще используют культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль- туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта- пов развития патологического процесса, обусловленного присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти- ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи- ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу- ченные из специфических тканей больного человека, либо выде- ленные из тканей линейных животных, служащих генетической моделью наследственного заболевания.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
