¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦

¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦

¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦

¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦

¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦

¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦

L-------------------+------------+-------------+-------------

Как следует из представленных данных, введение чужерод- ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по- мощи некоторых физических способов доставки (электропоации, бомбардировки частицами золота), так и, практически, при всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет- ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства- ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра- вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге- на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности способны к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс- прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи, что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола- гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,

Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от- сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%) трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо- кой пакующей способностью (включение генетической конструк- ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не- интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он- когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек- тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).

Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер- шенствование методов трансформации клеток человека.

9.4.1. Основные векторные системы.

В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.

Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи- муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина- лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес- кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую последовательность определенного гена, инсертированную в экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со- держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе- та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду- цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь- ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген

(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про- изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре- дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз- мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по- лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак- териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.

Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус- ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.

9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот.

Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.

Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу- жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо- жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает- ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1 года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб- риллах (Hansen et al.,1991).

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции

(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук- леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи электропорации (кратковременного воздействия сильным элект- рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод- ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди- ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки, который при наличии специального генно- го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et al., 1990).

Для повышения эффективности переноса обычно используют системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо- действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег- чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс- твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой доставки является система кальций-фосфатной копреципитации, широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс- трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка- честве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован- ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую- щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген- ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри- мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).

Важным компонентом системы является аденовирус или его

N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу- зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн- досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес- ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс- трукций, их несомненную перспективность для генной терапии in vivo (Hodgson, 1995).

Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и физико-химического подхода при конструировании систем для переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно- вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа- га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер- тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили- зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз- мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес- печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю- щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после- довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель- ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер- нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно функционирует.

Направленный перенос генов во многие типы клеток, со- держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде- альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре- цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг- менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб- ная система разработана для рецептор-опосредованного генного переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова- нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли- мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет- ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо- цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли- зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной

ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под- ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы клеток.

9.4.3 Липосомный метод трансфекции.

Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег- радации лизосомальными ферментами достигаются при использо- вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла- дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли- пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица- тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен- но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф- фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь- ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта- мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом получена в экспериментах на культурах клеток при использова- нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим пептидом грамицидином S.

Особенно перспективными в последнее время представляют- ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе- чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет- ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе- реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До- казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге- на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи- вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе- ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен- ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро- вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49