Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами.
ПДРФ анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты, либо ПЦР анализ полиморфизма проксимальных по отноше- нию к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.
Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследствен- ные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя, главным образом, из того насколько они изучены с молекулярно
-генетических позиций, их актуальности для пренатальной ди- агностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так, что именно такие заболевания как муковисцидоз, миодистрофия
Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурия, то 4 0есть 4 0социально наи- более значимые, раньше других генных болезней стали предме- том детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России (см. Баранов, 1991, 1994;
Baranov,1993; Евграфов, Макаров, 1987).
Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объекта- ми молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные 4 0болезни как гиперхолестерине- мия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1 антитрипсина, мито- хондриальные болезни. 4 0Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ве- дутся исследования по генотерапии. 4 0Мы не касались также ра- бот проводимых, 4 0главным образом, 4 0в возглавляемой профессором
Е.И.Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных забо- леваний, 4 0таких как диабет, гипертония, ишемия сердца. Ре- зультаты этих 4 0исследований 4 0будут, по-видимому, предметом следующих обзоров и монографий.
ГЛАВА I
СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене- тический код.
Универсальная генетическая субстанция или "энциклопедия жизни", ДНК, содержит информацию, необходимую для синтеза белков и нуклеиновых кислот, присутствующих во всех типах клеток как про- так и эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кис- лоты (ДНК) - это нитевидные молекулы, состоящие из четырех расположенных в варьирующем порядке нуклеотидов: пуринов - аденина и гуанина, и пиримидинов - цитозина и тимина, соеди- ненных в полинуклеотидную цепь с остовом из чередующихся ос- татков сахара - дезоксирибозы, и фосфата. Последовательность нуклеотидов ДНК или пар оснований составляет информационную емкость молекулы, определяя порядок синтеза и аминокислотную последовательность белков в соответствии с универсальным для всех живых существ трехбуквенным - триплетным, генетическим кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеиновые кислоты представля- ют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроиз- водству или репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Записывается последовательность ДНК слева направо (5' - 3') первыми заг- лавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся од- новременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах от нескольких нуклеотидов до миллиардов пар оснований (п.о.). В качестве единиц измерения размеров ДНК используются также килобазы (kb) и мегабазы
(mb) - последовательности, соответствующие тысячи и миллиону пар оснований, соответственно.
ДНК могут существовать как в виде однонитевых, так и в виде двухнитевых молекул. Двухнитевые или двухцепочечные мо- лекулы образуются за счет химического комплементарного спа- ривания между аденином и тимином (А - Т) и между гуанином и цитозином (Г - Ц). Эти водородные связи между парами нуклео- тидов достаточно непрочные, так что цепи ДНК могут легко диссоциировать - разделяться, и ассоциировать - соединяться, при изменении температуры или солевых концентраций. При каж- дом цикле ассоциаци - диссоциации или, как еще говорят, от- жиге - плавлении, будет точно воспроизводиться двухнитевая структура - дуплекс, устойчивость которого определяется со- ответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры, представленные полностью комплементарными нитями ДНК. Про- цесс образования дуплексов носит название гибридизации. Спо- собность к комплементарному спариванию оснований - одно из самых замечательных свойств ДНК, определяющих возможность ее саморепликации и точного выбора специфических участков акти- вации молекулы в процессе считывания генетической информа- ции. Это свойтво широко используется в молекулярной биологии для поиска и идентификации нужных последовательностей в ог- ромных молекулах ДНК при использовании в качестве зондов ее сравнительно небольших меченых фрагментов.
У человека большая часть ДНК- 3.2 миллиарда пар основа- ний, находится в ядрах клеток в виде 46 плотно упакованных, суперскрученных за счет взаимодействий с ядерными белками структур, называемых хромосомами. Сравнительно небольшая часть ДНК - около 5%, пристствует в митохондриях - органел- лах цитоплазмы, обеспечивающих процессы дыхания и энерегети- ческого обмена клеток эукариот. В большинстве соматических клеток ДНК представлена в двух копиях - по одной в каждой хромосоме. Таким образом, в клетках присутствуют 23 пары хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - аутосомы, и одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Наличие Y хромосомы определяет мужской пол особи. При записи нормального карио- типа индивидуума указывается общее число хромосом и тип по- ловых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип мужчины -
46,XY, а женщины -46,XX. В процессе гаметогенеза происходит случайное расхождение гомологичных хромосом в мейозе и в каждой зрелой половой клетке - гамете, остается только 23 хромосомы, то есть гаплоидный набор хромосом. При этом в каждой гамете сохраняется лишь одна половая хромосома - го- носома. В яйцеклетках это X хромосома, тогда как сперматозо- иды с равной вероятностью несут как X, так и Y хромосому, то есть пол будущей особи детерминируется геномом сперматозои- да. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанав- ливается. В соответствии с современными представлениями ге- ном человека состоит из 25 хромосом, 22 из которых аутосомы,
2 половые хромосомы и одна митохондриальная . В каждой клет- ках присутствует порядка 1000 митохондрий, а в каждом мито- хондрионе содержится около 10 кольцевых митохондриальных хромосом, сходнах с хромосомами бактерий. Таким образом, в клетках присутствует около 1000 копий митохондриальных хро- мосом.
В хромосомах эукариот ДНК находится в двухнитевой форме, что обеспечивает возможность ее точной репликации при каждом цикле деления клетки. Одна нить кодирующая или смысловая, комплементарная ей нить - антисмысловая. Декодирование ин- формации, заключенной в молекуле ДНК, или процесс транскрип- ции, осуществляется за счет избирательного синтеза молекул
РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называе- мых первичных РНК транскриптов. Транскрибируемые участки ДНК носят название генов. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) по своей структуре очень сходны с молекулами ДНК. Они также состоят из четырех нуклеотидов, только одно из пиримидиновых основа- ний - тимин, заменено на урацил и в сахарозном остове вместо дезоксирибозы представлена рибоза. Молекулы РНК существуют только в однонитевой форме, но могут образовывать дуплексы с молекулами ДНК. После синтеза молекулы РНК претерпевают достаточно сложную модификацию - процессинг. При этом про- исходят изменения в концевых участках молекул и вырезаются области, гомологичные интронам - некодирующим частям гена.
Этот процесс называется сплайсингом. В результате из первич- ных РНК транскриптов образуются молекулы информационной или матричной РНК (мРНК), представляющие собой непрерывную последовательность нуклеотидов, гомологичную только экзонам
- смысловым участкам гена. Молекулы мРНК в виде рибонуклео- протеиновых гранул выходят из ядра в цитоплазму и соединяют- ся с рибосомами, где происходит процесс трансляции - синтез полипептидной цепи. Трансляция мРНК происходит в точном со- ответствии с генетическим кодом, согласно которому последо- вательность из трех нуклеотидов РНК - кодон, соответствует определенной аминокислоте или сигналу терминации синтеза по- липептидной цепи (Табл.1.1). Реализация генетического кода осуществляется с участием 20-ти типов транспортных РНК
(тРНК), единственных нуклеиновых кислот, содержащих в своем составе наряду с нуклеотидами одну из аминокислот. тРНК име- ют кленовообразную форму, в хвостовой части молекулы распо- ложена определенная аминокислота, в точном соответствии с последовательности из трех нуклеотидов в области, называемой антикодоном. Прохождение мРНК по рибосоме является сигналом приближения к рибонуклеопротеидному комплексу той тРНК, у которой последовательность нуклеотидов в антикодоне компле- ментарна кодирующему триплету мРНК. Таким образом транспор- тируется соответствующая аминокислота и осуществляется пос- ледовательный синтез полипептидной цепи. Митохондрии имеют свою автономную систему белкового синтеза: рибосомальные
РНК, мРНК и транспортные РНК.
Генетический код универсален для всех живых существ - это одно из его главных свойств. Небольшие отличия в струк- туре кода найдены только для митохондриальной ДНК. Так в ми- тохондриальном генетическом коде стоп кодонами являются триплеты АГА и АГЦ, кодирующие аргинин в ядерной ДНК
(Табл.1.1). Универсальность генетического кода служит наибо- лее веским аргументом в пользу гипотезы об едином источнике возникновения жизни на земле и о филогенетическом родстве всех видов живых существ. Кроме того, именно это свойство обеспечивает возможность прочтения в любых модельных клеточ- ных системах искусственно введенной генетической информации, сконструированной из фрагментов ДНК разного видового про- исхожденеия. Таким образом, вся генная инженерия основана на универсальности генетического кода. Другим свойством генети- ческого кода является его вырожденность, заключающаяся в том, что все аминокислоты кроме двух кодируются несколькими вариантами триплетов. Действительно, из 64 возможных комби- наций нуклеотидных триплетов РНК три соответствуют термини- рующим кодонам - ochre, amber и opal, остальные варианты
(61) кодируют 20 аминокислот, причем триплеты, кодирующие одну и ту же аминокислоту, как правило, различаются по третьему нуклеотиду в кодоне. Таким образом, зная нуклеотид- ную последовательность кодирующего участка ДНК, можно одноз- начно прогнозировать аминокислотную последовательность соот- ветствующего полипептидного фрагмента, тогда как одна и та же аминокислотная последовательность может кодироваться раз- личным образом. При этом, число возможных вариантов кодирую- щих ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.
На следующем этапе полипептидные цепи транспортируются к специфическим органеллам клетки и модифицируются с образо- ванием зрелого функционально активного белка. В некоторых случаях информация с молекул РНК может обратно транскрибиро- ваться в молекулы ДНК. В частности, при обратной транскрип- ции мРНК образуются молекулы комплементарной ДНК - кДНК, в которой в зависимости от полноты процесса представлены частично или полностью все смысловые кодирующие последова- тельности гена. Рассмотренная схема реализации однонаправ- ленного потока информации ДНК-РНК-Белок составляет основу центральной молекулярно-биологической догмы - рис.1.1.
Более детально с процессами репликации, транскрипции, процессинга и трансляции можно ознакомиться в многочисленных руководствах по молекулярной биологии, цитологии и генетике
(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).
1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и кле- ток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагмен- тов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 грамма сырой ткани или из 10!9 клеток обычно получают 2 миллиграмма ДНК. У человека ДНК, чаще всего, вы- деляют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором, пре- пятствующим коагуляции (например, с глюгециром или гепари- ном). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядер- ные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих де- натурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы-К с последующей фенол - хлоро- формной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в эта- ноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экс- трагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
