Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук- леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли- гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по- ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен- тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот- ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен- тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му- тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами
(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы- ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.
Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе- роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани- рования точечных мутаций является модифицированный вариант
ASO, так называемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра- зу много точечных мутаций и доступен автоматизации
(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически- ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби- лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу- ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго- нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра- диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол- ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию, обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра- ботки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге- не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот- ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)
Очень простой метод обнаружения и идентификации описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК основан на анализе характера электрофоретического разделения продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми- рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем расположение дуплексов очень специфично для различных му- тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици- рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с высокой степенью вероятности идентифицировать известные му- тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре- менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен- тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра- ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав- томатизации процесса поиска и идентификации известных мута- ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций
Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда- ются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются боль- ные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях, где имеется большая выборка больных и можно предполагать высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей, за- частую, определяется диагностическими возможностями лабора- торий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более простые и эффективные методы молекулярной диагностики, поз- воляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерози- гот среди их родственников или среди определенных групп населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является его корреляция с тяжестью течения заболевания, то есть фе- нотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерози- готном состоянии, а также в компаунде с другими мутантными аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обна- ружено большое число аллелей, которые по своему клиническо- му проявлению могут быть подразделены на различные группы, от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молеку- лярная диагностика мутаций может иметь определяющее значе- ние для прогнозирования развития заболевания и выбора адек- ватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в настоящее время разработаны и успешно осуществляются во многих странах для таких распространенных заболеваний как серповидноклеточная анемия, муковисцидоз (Rene et al.,1994). Реализация этих программ наряду с большой меди- цинской пользой приносит и массу социальных проблем, неко- торые из которых будут рассмотрены ниже.
ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
В.Н.Горбунова, В.С.Баранов
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене- тический код.
Раздел 1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
Раздел 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.
Раздел 1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
Раздел 1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг.
Раздел 1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Раздел 1.7 Полимеразная цепная реакция.
ГЛАВА II. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1 Определение генома и его основных элементов.
Раздел 2.2 Повторяющиеся последовательности ДНК.
Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге- ны.
Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген", транскрипция, регуляторные элементы генов.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест- рикции, ПДРФ-анализ.
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факультатив- ные элементы генома.
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка сцепления.
Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический анализ, картирование анонимных последова- тельностей ДНК.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Раздел 3.4 Хромосом-срецифические библиотеки генов, пульсирующий гель-электрофорез.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция ге- нов.
Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
Международная программа "Геном человека".
ГЛАВА IY. ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК-
ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му- таций.
Раздел 4.2 Генетическая гетерогенность наследственных заболеваний.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Раздел 4.4 Идентификация структурных мутаций, изоляция мутантных ДНК.
Раздел 4.5 Первичная идентификация точечных мутаций.
Раздел 4.6 Молекулярное сканирование известных мутаций.
ГЛАВА Y. ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. ЭНДОГЕННЫЕ
МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Популяционный анализ мутаций, полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
Раздел 5.2 Частоты спонтанного мутагенеза.
Раздел 5.3 Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му- таций в популяциях.
ГЛАВА YI. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор адекватных биологических моделей.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция и исследование мРНК, искусственные транскрипционные системы.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе- мы.
ГЛАВА VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ
ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг- ностики.
Раздел 7.2 ДНК-диагностика при различных типах наследо- вания.
Раздел 7.3 Группы риска, поиск гетерозиготных носите- лей мутаций.
Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов в пренатальной диагностике моногенных болез- ней.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, общая схема пренатальной диагностики, точность прогнози- рования.
ГЛАВА YIII. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1 Генетические линии животных.
Раздел 8.2 Трансгенные животные.
Раздел 8.3 Экспериментальное моделирование.
Раздел 8.4 Конструирование модельных генетических ли- ний животных.
Раздел 8.5 Методы направленного переноса генов.
ГЛАВА IX. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.
Раздел 9.1 Определение, историческая справка, программы генной терапии.
Раздел 9.2 Типы генотерапевтических вмешательств, выбор клеток-мишеней.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те- рапии.
Раздел 9.4 Конструирование векторных систем и совер- шенствование методов трансформации клеток че- ловека.
9.4.1 Основные векторные системы.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных заболе- ваний.
Раздел 9.6 Генотерапия ненаследственных заболеваний: опухоли, инфекции.
Раздел 9.7 Некоторые этические и социальные проблемы ген- ной терапии.
ГЛАВА X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 10.1 Хромосомная локализация и принципы класси- фикации генов наследственных болезней.
Раздел 10.2 Метаболические дефекты лизосомных фермен- тов. Болезни накопления.
Раздел 10.3 Болезни экспансии, вызванные "динамически- ми" мутациями.
Раздел 10.4 Моногенные наследственные болезни, диаг- ностируемые молекулярными методами в России.
10.4.1 Муковисцидоз.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
10.4.3 Гемофилия А.
10.4.4 Гемофилия B.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
10.4.6 Фенилкетонурия.
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
