(Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследо- вания методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз, то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.

Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома

(всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов

(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассо- циации РНК в культуре клеток число генов оценивается между

20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000

(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов человека проведены в последнее время и основаны на оценке числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 % генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали- зированные функции дифференцированных клеток, находятся об- ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо- лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,

1993). Практически такое же число генов (64 000) определено недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова- тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).

Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000 отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть генов.

Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона, где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда- ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен- ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами и интронами имеются консервативные канонические последова- тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива- ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны- ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после- довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с одного и того же первичного РНК транскрипта.

Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента

РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе- чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от- ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера- за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.

РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт- ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва- ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами

(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру- ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала, представляющего собой один или несколько терминирующих кодо- нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.

Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс контролируется промотором - специальной регуляторной после- довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной, как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под контролем одного промотора считывается несколько генов c об- разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные области различных генов довольно разнообразны по своему нук- леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак- терно наличие консервативной последовательности из 7 основа- ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог- несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера- зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80 п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто расположена другая консервативная последовательность из 9 п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание

РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су- щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала его кодирующей части располагаются другие регуляторные последовательности, так называемые инхансеры (усилители), способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе- ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут работать независимо от их ориентации по отношению к сайту инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля- ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла- бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод- вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции, трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти механизмы более детально рассмотрены в других разделах.

Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест- рикции, ПДРФ-анализ.

Кодирующие и регуляторные области структурных генов на- иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора.

Действительно, небольшие изменения в этих последователь- ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза белка или к потере его функции, что, как правило, драмати- ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу- щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател- литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме- жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро- дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколе- ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть использовать в качестве обычных менделевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморф- ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи- вости в различных популяциях.

Экспериментально легко выявляются два варианта геномно- го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа- ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка- чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ- лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен- чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети- ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре- зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом, при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.

Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро- мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на

300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь- зован для молекулярной маркировки специфических участков ге- нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател- литными повторами (Botstein et al.,1980).

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен- тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана- лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы- ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism

-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном- ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро- форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден- тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест- рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).

При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо- реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения

ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот- ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо- нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест- рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа- ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест- рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен- тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест- рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак- тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда- ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по- лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте

ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на- личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли- ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо- мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об- ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фраг- менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по- лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер- жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп- лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа- зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49