¦
---------------------+--------------+-----------------------+---------------
----------

Многим из приведенных в Табл.9.4 заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвящен- ные молекулярной природе патологического процесса, характе- ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а так же последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомя- нуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моно- генными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разра- ботаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна му- таций оптимальные схемы молекулярной обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследова- ния проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Ге- ном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследствен- ных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,

1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,

1993).

10.4.1 Муковисцидоз.

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь, молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структур- ных перестройках в области локализации предполагаемого гена.

Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи- тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро- мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую- щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара- нов, Гинтер, 1994).

Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе- лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка- налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб- раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко- висцидозе может быть полностью или частично нарушенной.

К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра- ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508 положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо- дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи- вает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до

50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части

России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро- мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является мутация W1282X (33%).

Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко- висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде- ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле- точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута- ции, её локализации и структуры аномального белкового про- дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не- которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости- гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару- шениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х ли- ниях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказа- лось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализа- цию и стабильность белка и снижает эффективность его функци- онирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993).

Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обна- руживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводя- щих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стер- та. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия, обусловленного аллельными сериями.

В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом

(Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты сле- дующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),

394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно на- шим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муко- висцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% се- мей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости

(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - ми- нисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена

СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохи- мическим анализом амниотической жидкости на содержание фер- ментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;

Баранов и др.,1991).

Методами направленного мутагенеза (gene targeting см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы- яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано, что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других - поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сход- ных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молеку- лярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработ- ки и испытания терапевтических мероприятий, включая геноте- рапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы ге- нотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и

Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации ген- ноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и мо- дельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, нача- тые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных куль- тур.

10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.

Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - мио- дистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию

Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин, входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист- рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии.

В соответствии с современными представлениями (Ahn,

Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож- ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю- чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6- и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси- руются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи- цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще- еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка- нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото- рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса, экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в

Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу- чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро- фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993).

В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи- ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух

"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова- ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси- мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене- зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.

Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%

(Passos-Bueno et al., 1992).

Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де- летирован не только весь ген, но достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44, протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз- рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб- ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо- зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко- торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы, размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов- торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста- бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб- ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци- ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49