В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не- гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).
Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор- мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо- жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки - дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута- ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук- леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му- тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.
Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с
МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи- мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен- ные формы.
Разработаны очень эффективные методы диагностики деле- ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре- менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз- воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де- леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи- ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп- лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование
(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген- ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;
124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид- ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше- ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и др., 1990).
Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад- ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов) половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни- кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран- них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори- ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа- ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце- нить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительст- во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали- чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно- го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al.,1992).
У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто- химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро- фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от- вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят- ный механизм такого явления - возникновение второй сомати- ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки считывания, вызванный основной делецией. В результате му- тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль- ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).
Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна - mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации, спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,
1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол- ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини- ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже- на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо- на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).
В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи- альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер- ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро- фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив- ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,
1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри- венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант- ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной
ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных
(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче- видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да- лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии МД по срав- нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини- ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу
IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи- мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро- фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен- но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и в нашей стране.
10.4.3 Гемофилия А.
Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора
YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном
F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя- зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге- ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули- рует его активность.
Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер- жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо- дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009 нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность
(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806 п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не- известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт- роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;
Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22 оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост- ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи- тельное место локализации бинаправленного промотора для ге- нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые копии гена F8A (Lakich et al.,1993).
Во время процессинга первичного белкового продукта гена
F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от- щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и
N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко- личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак- тивность белка сохранена, но его количество резко снижено
(McGinnis et al.,1993).
Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% - семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает, что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя- ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации, могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что вероятность повторного рождения больного ребенка у них также повышена.
Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв- ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При- мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика- ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова- на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло- кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,
Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего большинства мутаций гена F8C характерно практически полное отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя- женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол- ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа- лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А
(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена является гомологичная рекомбинация между идентичными после- довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22
F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).
Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре- гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза, связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен- тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен- ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк- зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1 последовательности представляют собой специфическое для ге- нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов- торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба
L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот- ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10
F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле- мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре- конструируемые аминокислотные последовательности были высоко идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.
Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде- ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую- щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо- зиции.
Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу- ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1
(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по- лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне- генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
