До сих пор мы рассматривали основные структурные эле- менты генома человека, положение которых в соответствии с представлениями классической генетики достаточно постоянно.
Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существо- вании большого числа мобильных генетических элементов, присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество может варьировать в различных клет- ках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изу- чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля- ется способность существовать как в интегрированном с хро- мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом, плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо- бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо- вательности составляют около 12% гаплоидного набора
(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50
000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около
6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от
300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге- нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп- ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило, относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не существует четких границ между облигатными и факультативными элементами генома, так как возможен взаимный переход от од- ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об- ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу- ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных перестроек и обратной транскрипции.
Факультативные элементы существуют в геноме как популя- ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной ха- рактер по сравнению с классическими мутациями в структурных локусах. Для описания изменений в факультативных элементах предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот тер- мин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания по- ведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приво- дить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мута- циям, вследствие простого перемещения факультативных элемен- тов или сдвига в соотношении между факультативными и обли- гатными элементами. В этих случаях мутации встречаются од- новременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упоря- дочены, могут происходить сразу во многих локусах и отлича- ются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределе- на первоначальной топографией факультативных элементов на хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные элементы могут рассматриваться как оперативная память гено- ма, так как во многих случаях спонтанное возникновение мута- ций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Счи- тается, в частности, что инсерционный мутагенез является причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока за- регистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et al.,1993).
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра- зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом смысле можно говорить о существовании в геноме человека структур более высокого иерархического порядка. Примером служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты
ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.
62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора- ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных
GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо- дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким образом, существуют относительно небольшие участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше, чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити- дина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую- щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после- довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля- ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили- рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' - сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3' последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене- тической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу- холевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках. Существует класс белков, которые специфическим об- разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз- можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен- тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив- ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде- тельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа- ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети- лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са- мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге- номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба- ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха- рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован- ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь- ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки- пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв- ляются характерной особенностью транскрибируемых участков генома. Их идентификация в клонированных последовательностях геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр- ные методы регистрации СрG островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур- но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та- ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви- димому, это необходимое, но не достаточное условие их экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме- няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко- торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион- ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи- тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа- ях это области функционально активных генов, находящихся в деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви- тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро- мосомных препаратах визуализировать функционально активные районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба- тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по- мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече- ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно только в те участки хромосом,где находятся функционально ак- тивные гены (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА YIII.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1. Генетические линии животных.
Большая роль в исследовании проблем генетики челове- ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей
(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую- щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также наличие большого числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе- нием генов наряду с возможностями использования очень мощных экспериментальных подходов для идентификации и клонирования генов линейных животных позволяют проводить параллельные исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.
Для многих моногенных заболеваний человека животные, несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а зачастую и единственными моделями для исследования молеку- лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече- ния, в том числе и с применением методов генной терапии
(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде всего, ведется, среди уже существующих генетических линий животных с установленным типом наследования определенных аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до- казательство идентичности мутантных генов и, соответственно первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных животных.
В различных питомниках мира, в том числе и в России, созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков до несколько сотен генетических линий различных эксперимен- тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню- хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно- гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости, удобства содержания, относительной легкости эксперименталь- ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые из этих линий представляют собой случайные находки, другие, а их большинство, получены в результате действия различных мутагенных факторов. Так, значительное число биологических моделей было получено путем биохимической селекции потомства мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз- мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия, почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу- чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу- чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного гена.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
