Для генотипирования мутаций, то есть для выяснения при- роды мутантных аллелей у больного и его родителей использу- ются различные стандартные методы, подробно изложенные в главе IV. Выбор конкретного метода зависит от типа предпола- гаемых мутаций и от методических возможностей диагностичес- ких центров. При отсутствии у пробанда наиболее частых и ра- нее описанных мутаций его ДНК может быть направлена в специ- ализированные молекулярно- генетические лаборатории для бо- лее тщательного анализа с использованием всего комплекса ме- тодов идентификации мутаций вплоть до получения и секвениро- вания мутантных кДНК- вых последовательностей гена. Однако, подобные исследования очень дороги, требуют много труда и времени и потому в обычной клинической практике используются достаточно редко. В этих случаях чаще прибегают к косвенным методам молекулярной диагностики (см. раздел 7.1). Для мно- гих заболеваний, эти методы все еще остаются единственно возможными (см.Главу X). Однако, как уже указывалось, они требуют обязательного обследования полной семьи, включая больного ребенка. При его отсутствии молекулярное маркирова- ние мутантных генов у гетерозиготных родителей становится невозможным, а, следовательно, невозможна и пренатальная ди- агностика.

Идентификацию мутантных генов осуществляют путем срав- нения маркерных генотипов родителей и больного ребенка. Если не произошел кроссинговер между маркерным локусом и геном, все больные дети в семье должны иметь одинаковый маркерный генотип. Поэтому при проведении пренатальной диагностики сходство генотипов плода и пробанда является необходимым, однако в ряде случаев, вовсе не достаточным условием для подтверждения наличия заболевания. Так, например, у гомози- готных по маркеру родителей все дети будут иметь одинаковый генотип по этому локусу независимо от присутствия мутантных аллелей гена. Необходимым условием дифференцировки нормаль- ных и мутантных генов у носителей мутаций является их сцеп- ление с разными аллелями маркерного локуса. Поэтому, дискри- минация мутантных генов у родителей возможна только с по- мощью гетерозиготных маркеров. При этих условиях мутантные гены родителей могут быть определены по тем маркерным алле- лям, которые присутствуют у больного ребенка. Однако, иден- тификация по маркерным аллелям обоих мутантных генов возмож- на лишь в тех случаях, когда родители гетерозиготны, а про- банд (больной) гомозиготен по маркерному локусу.

Возможность идентификации мутантных генов родителей на основе анализа маркерных генотипов определяет информатив- ность семьи по отношению к данному маркеру. На Рис.7.1 представлены возможные маркерные генотипы в полностью и час- тично информативных, а также в неинформативных семьях при определении их путем блот-гибридизации с ДНК-зондом. Анало- гичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих по- лиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В инфор- мативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличает- ся от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса, поэтому можно проследить наследование мутантных генов при каждой беременности. В этом случае сходство маркерных гено- типов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прог- ноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип. В частично информативных семьях идентифицируется только один из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ре- бенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей.

В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и про- банда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%.

Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но по- ловина из них будет нести один из мутантных аллелей. Неин- формативный маркер не пригоден для идентификации мутантных генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диаг- ностики в данной семье. При отсутствии полной информативнос- ти необходимо исследовать другие сцепленные с геном поли- морфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, ко- торые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состо- янии. В частично информативных семьях можно проводить прена- тальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и в полностью информативных семьях, при одновременном исполь- зованием двух полиморфных локусов, каждый из которых марки- рует разные мутантные гены обоих родителей. Информативными оказываются также те семьи, в которых один из мутантных ал- лелей может быть идентифицирован прямым анализом соответс- твующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моно- генных наследственных заболеваний количество идентифициро- ванных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контро- лирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей высокого риска оказались полностью информативными, а значит, пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с использоваанием молекулярных методов тестирования состояния плода.

Таким образом, при отсутствии возможности прямой иден- тификации соответствующих мутантных аллелей, анализ информа- тивности семьи следует начинать с наиболее полиморфных мар- керных локусов. так как при этом больше вероятность того, что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеп- лению, так как чаще всего информативность семей в отношении маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению, будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению ло- кусах обуславливает повышенную вероятность таких событий, при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются го- мозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отно- шении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы, находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.

Следует также учитывать, что определенные аллели поли- морфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей однократно много лет назад и распросранившейся в популяции, будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению.

Примером может служить неравновесность между delF508 (ориен- тировочный возраст возникновения 30-50 000 лет) и 6-ти член- ным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза

(Chebab et al., 1993; Агбанглы и др., 1994). Поэтому в семь- ях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное значение которой определяется детерминантом неравновесности по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю, окажут- ся также гомозиготами и по мутации, то есть будут больны.

Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только на этой информации, однако, её следует учитывать при выра- ботке комплексного заключения относительно здоровья будущего ребенка.

Во всех случаях при использовании косвенных методов мо- лекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркер- ный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точ- ностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем и маркерным локусом. Поэтому, чем ближе расположен маркер по отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки при проведении пренатальной диагностики. Для того чтобы пол- ностью избежать или, по крайне мере, резко снизить вероят- ность такой ошибки, желательно использовать внутригенные маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный ал- лель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень протяженными генами ( например геном дистрофина длиной около

2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.

Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог- нозирования.

Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному тестированию, практически, не зависит от формы нозологии, так как для анализа генов и мутантных аллелей используется один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож- дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение пренатальной диагностики становится возможным на любой ста- дии развития и при любом сроке беременности.

ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека, безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп- ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде- лить ее в самостоятельное научно-практическое направление - доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней

(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до- имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп- ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X

-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ- кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек- леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери- рованных зародышей после их искусственной трансплантации в матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос- сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае- мой по числу наступивших беременностей и родов, методы доим- плантационной диагностики наследственных болезней будут привлкать к себе все большое число исследователей. Однако, практическая значимость такого подхода в виду его высокой стоимости и недостаточной надежности еще сравнительно долго будет оставаться проблематичной, по крайней мере, в нашей стране.

Обобщенный опыт различных молекулярных диагностических центров мира свидетельствует о том, что оптимальным для пре- натальной диагностики является первый триместр беременности

(10-12- недели), поскольку при неблагоприятном прогнозе бе- ременность может быть прервана обычным медицинским абортом.

Зачастую молекулярную диагностику проводят и во втором три- местре беременности (обычно на 17-21 неделях). Необходимые для анализа образцы ДНК плода выделяют из биоптатов хориона

(плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или из лимфоцитов пуповинной крови при помощи соответствующих инвазивных процедур - хорионбиопсия, плацентобиопсия, амнио- центез или кордоцентез, которые проводятся под контролем уль тразвука (Рис. 7.3). Подробнее об этих методах, их преиму- ществах и недостатках можно узнать в соответствующих моног- рафиях и обзорах (Рарр,1992; Баранов, 1994; Баранов и др.,

1994). Диагностика во 2-м триместре беременности нередко по- казана для неинформативных семей в случае тех нозологий, пренатальная диагностика которых принципиальна возможна пу- тем биохимического тестирования первичных нарушений (напри- мер муковисцидоз) или оценки каких-либо иных проявлений бо- лезни у плода.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49