(Горбунова и др., 1991; Baranov et al., 1992); в случае ге- мофилии А - прямым серологическим исследованием активности фактора Y11 свертывания крови (Aseev et al., 1994); в случае миодистрофии Дюшенна - иммуноцитохимическим анализом дистро- фина в биоптатах мышц плода (Hoffman et al., 1992) и т.д.

Следует однако подчеркнуть, что современный уровень молеку- лярных знаний о природе гена, его мутациях и полиморфизмах позволяет в идеале проводить молекулярную диагностику наибо- лее частых моногенных заболеваний, практически, во всех слу- чаях. Возможности молекулярной диагностики в России пока весьма ограничены ( Baranov, 1993 ;см. Глава X). Кроме того, ситуация осложняется сравнительно поздним (часто, уже во время беременности) обращением семей высокого риска на пре- натальную диагностику, что не позволяет провести молекуляр- ные исследования ее информативности в полном обьеме. Связано это, в первую очередь, с плохой информированностью населения о работе соответствующих медико-генетических служб.

Из всех существующих способов пренатальной диагностики методы, основанные на анализе ДНК, являются наиболее точны- ми, так как они выявляют первичные нарушения в структуре ге- нов. Это прежде всего относится к тем заболеваниям, диагнос- тика которых осуществляется путем прямой идентификации му- тантных аллелей. Тем ни менее, даже в этом случае оконча- тельное заключение о здоровье будущего ребенка хотя и приб- лижается к абсолютному, но все же носит вероятностный харак- тер. Основным источником ошибок при проведении пренатальной диагностики служит возможная контаминация материала плода, используемого для постановки диагноза, другими тканями, в первую очередь, материнского происхождения. Поэтому сразу после взятия диагностического материала путем биопсии хорио- на, амниоцентеза или кордоцентеза проводят тщательную его оценку с использованием разнообразных лабораторных методов.

Отличие молекулярных методов тестирования от биохимических или любых других заключается в их повышенной чувствительнос- ти и огромной разрешающей способности. Загрязнение материала особенно опасно в тех случаях, когда прогноз дается на осно- ве анализа амплифицированных фрагментов ДНК. Попавшие в тес- тируемые образцы клетки чужеродного происхождения могут пос- лужить источником донорской ДНК для ПЦР и тогда может быть получено несоответствующее действительности заключение о том, что ребенок будет здоров. Риск подобных ошибок может быть значительно уменьшен при работе в стерильных условиях и при постановке анализов в нескольких параллельных пробах.

Конечно, в любом диагностическом центре возможны лаборатор- ные ошибки чисто технического порядка, не зависящие от ис- пользуемых методов тестирования. Однако, достоверность прог- нозирования, основанного на прямом анализе мутантных аллелей плода, обычно, превышает 99%. При использовании косвенных методов молекулярной диагностики появляется дополнительный риск ошибки, связанный с возможностью рекомбинации между му- тантным аллелем и маркерным локусом (особенно при больших размерах гена, как, например, в случае гена дистрофина).

Конкретное значение этого риска зависит от взаимного распо- ложения используемых для диагностики маркеров и соответству- ющих мутантных аллелей. Обычно, для молекулярной диагностики используют маркеры, частота рекомбинации которых с мутантны- ми аллелями гена не превышает десятых, а иногда и сотых до- лей процента.

В случае неблагоприятного прогноза в отношении здоровья будущего ребенка решение о прерывании или продолжении бере- менности принимают родители на основании предоставленного в их распоряжение общего заключения. После рождения ребенка или прерывания беременности желательно проводить верификацию диагноза всеми доступными для этого методами, включая и те, которые были использованы для постановки пренатального диаг- ноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При всем разнообразии тем, затронутых в монографии, весь изложенный в ней материал, по-сути, касается трех основных проблем : 4(1) 0генетическое картирование и геном че- ловека, 4(2) 0молекулярная диагностика генных болезней,
4(3) генокоррекция наследственных дефектов и генотерапия. В реше- нии каждой из названных проблем достигнуты серьезные успехи.

Напомним некотрые из них.

Известно, что первый ген человека (ген цветной слепо- ты-дальтонизма) картирован на Х-хромосоме человека в

1911г. Первый аутосомный ген - только в 1968г. К 1973 на всех хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к

1994г. на генетических картах уже локализовано свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей (главным образом, фрагмен- тов кДНК экспрессирующихся генов-EST см.Главу III.), а также

4более 05 000 полноразмерных структурных генов. Благодаря мно- гочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микроса- теллитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2 сантиморганные) генетические карты для каждой хромосомы че- ловека. Это позволило перейти от функционального к позицион- ному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию новых генов не- посредственно на физической карте ДНК целого генома.

По мнению авторитетных специалистов по генетическому картированию таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и др 4угих, 0дальнейшее наращивание плотности молекулярных марке- ров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что в процессе идетификации все новых и новых генов методом EST, новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее оптимистично обстоят дела и с секвенированием, т 4о 0е 4сть
0вы- яснением первичной нуклеотидной последовательности всей двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеоти- дов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40 центов и продолжает снижается. Причина этого - широкая авто- матизации монотонного процесса секвенирования. Так, 10 робо- тов фирмы Applied Biosystems за одну неделю секвенируют бо- лее 30 000 000 п 4ар 0о 4снований. 0Дальнейшее совершенствование технологии секвенирования 4, 0создани 4е 0принципиально новых под- ходов (метод "чипов"-Мирзабеков А.Д., Ed.Southern ),

4повышающих в десятки раз 0степен 4ь 0автоматизации этого про- цесса в высокоспециализированных центрах позволяет наде- яться, что секвенирование всего генома человека будет завер- шено в 2 006 году, а вполне вероятно и к 2 000 году!

Однако, само по себе завершение гигантского по замыслу и грандиозного по реализации научного проекта "Геном человека" отнюдь не означает, что процесс познания генома завершен.

Уже сейчас становится очевидным, что не существует какого-то усредненного генома человека, каждый геном как и каждый че- ловек сугубо индивидуален. Эта индивидуальность генома про- является не только на уровне отдельной личности, но и на уровне этнических групп, наций, отдельных популяций и рас

(Cavalli-Sforsa,1994). Геном человека как система динамич- ная, очень разнообразен. Анализ этого разнообразия

(diversity) - одно из важнейших продолжений программы Геном человека. Еще более актуальным является выяснение "функцио- нальной карты генома". Секвенирование позволит расшифровать порядок всех 3 4.5 0х 10 4! 09 нуклеотидов. Но ведь это только на- чало. Определить границы генов, выяснить положение много- численных регуляторных элементов, их интронно-экзонную структуру и, наконец, функциональное назначение каждого из

60 000 генов, назначение которых пока неизвестно - вот сле- дующая поистине глобальная задача молекулярной генетики.

Вполне вероятно, что именно на этом пути удастся решить за- гадку "избыточной ДНК", понять эволюцию (филогенез) генома человека и ,возможно, расшифровать партитуру симфонии жизни

- т 4о 0е 4сть 0последовательность включения и выключения генов в ходе онтогенеза.

На генетические карты человека уже в 1994г. нанесено

933 гена, мутации которых приводят к различным наследствен- ным заболеваниям, причем более 400 из них проклонированы, т 4о 0е 4сть 0выделены в чистом виде и размножены вне оргаизма че- ловека в составе ДНК фагов, вирусов, дрожжей и бактерий. Для многих из этих генов, в особенности, сопряженных с наиболее частыми, социально значимыми заболеваниями, подробно изучены спектры мутаций, охарактеризованы аллельные полиморфизмы и разработаны схемы молекулярной диагностики. Причем, если в

1993г. таких заболеваний было около 130 (Bob Williamson), то в 1994 - более 600. По-сути, уже сегодня каждый наследствен- ный недуг, ген которого картирован, доступен молекуярной ди- агностике прямыми или косвенными методами.

Помимо моногенных болезней, проблемы молекулярной диаг- ностики которых в значительной степени уже решены, все боль- ше внимания сегодня уделяют мультифакториальным заболевани- ям. На повестке дня молекулярная диагностика предрасположен- ности к таким широкораспространенным недугам как атероскле- роз, ишемия сердца, онкологические 4, психиатрические 0заболе- вания, диабет и мн 4огое 0друг 4о 0е. Выяснение генетической приро- ды этих болезней, равно как досимптоматическая диагностика многих моногенных болезней с поздней манифестацией, ставит перед исследователями 4, 0т 4о 0е 4сть 0молекулярными биологами и врачами 4, 0проблему целесообразности такой досимптоматической диагностики, права личности на исключительность знаний о собственном геноме, точнее о тех мутациях и генетических предрасположенностях которые закодированы в нем еще до рож- дения. Для некоторых заболеваний 4( 0муковисцидоз, фенилкетону- рия) такая ранняя диагностика, безусловно, целесообразна, так как позволяет начать лечение до начала заболевания. Для тех же нозологий, где реальной терапии пока нет (хорея Ген- тингтона, другие болезни "экспансии", миодистрофия Дюшенна и др.) целесообразность такой диагностики и, главное, конфи- денциальность полученной информации широко обсуждаются.

Да, уже сейчас вполне реально говорить о "генетическом паспорте новорожденных", т 4о 0е 4сть 0о том, что уже вскоре после рождения с помощью автоматизированной системы удасться проа- нализировать весь спектр наиболее частых мутаций широко распространенных заболеваний как моногенной так и мультифак- ториальной природы 4, в 0том числе и генов, мутации которых с высокой вероятностью могут привести к раку молочной железы, толстого кошечника, к атеросклерозу, диабету и мн 4огим 0другим ттяжелым недугам. Жить 4, 0н 4и 0в чем себя не ограничивая, засу- нув как страус голову в песок, либо, зная, что у вас мутация в гене глутатионтранферазы, а следовательно, высока вероят- ность болезней легких (особенно рака) воздержаться от куре- ния ? Что лучше, добровольные ограничения и периодические осмотры или состояние счастливого неведения, грозящее неми- нуемой катастрофой ? А сколько мультифиакториальных заболе- ваний можно избежать, зная о слабых и сильных сторонах свое- го генома! В настоящее время в США провдятся массовые опросы населения, цель которых выяснить целесообразность досимпто- матической диагностики в семьях высокого риска, доступность

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49