(см. подробней Главу VIII). Однако, в клинической практике он еще не используется.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо- леваний.
Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander- son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,
1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys- tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли- кованной монографии (Culver, 1994).
Уже через год после первого введения маркерного гена в организм человека была проведена успешная клеточная сомати- ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен- ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон- центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс- твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз- вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под- держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич- ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн- зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре- менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд- никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен- ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо- цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо- ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo; отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут- ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.
Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет- няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных
T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу- зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир- кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор- мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак- теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более, чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор- ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут- ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых клинических испытаний была начата программа генной терапии
ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де- вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали- зация соответствующих биохимических и иммунологических пока- зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).
Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста- навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем, что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых
T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те- рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро- ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.
Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство- ловых клеток показана в экспериментах на приматах.
Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму- лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным заболеваниям. В
Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи- ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу- ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания, для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.
Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото- рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери- ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).
(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)
---T----------------T-----------------------T----------------T---- ¬
¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста- ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия ¦
+--+----------------+-----------------------+----------------+---- +
¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ ¦
¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ ¦
¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦
¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ ¦
¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦ ¦
¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ ¦
¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР ¦
¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦
¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ ¦
¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦
¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦
¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦
¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦
¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР ¦
¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ ¦
¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦ ¦
¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР ¦
¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦
¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦
¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР ¦
¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦ ¦
¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦
¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦
¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦ ¦
¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР ¦
¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦ ¦
¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР ¦
¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦
¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР ¦
¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦
¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР ¦
¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦
¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ ¦
¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦ ¦
¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦
¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ ¦
¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦
L--+----------------+-----------------------+----------------+---- -
Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.
Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле- дования и отрабатывались требования, необходимые для получе- ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).
Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь- ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива- ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток
(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле- ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек- ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо- дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки
(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то, что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ- ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек- тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че- ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по- казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже- нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост- ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции клеток крови соответствующими генами можно лечить не только собственно заболевания крови, но и использовать их для лече- ния многих других заболеваний как моногенной природы
(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).
Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод- ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас- ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо- леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз- ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе- ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.
Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио- фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно- го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про- должительность экспрессии значительно увеличивается, если генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас- тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо- бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина, диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар- кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны- ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко- жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма- нипуляций ex vivo.
Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний: опухоли, инфекции.
Параллельно с развитием исследований в области генокор- рекции наследственных дефектов успешными также оказались по- иски методов терапевтического использования смысловых после- довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин- фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических испытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо- лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому, прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо- гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными инфекционными заболеваниями, например, со спидом.
Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек- ции онкологических заболеваний.
---------------------------------T-----------------------------¬
¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦
+--------------------------------+-----------------------------+
¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦
¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦
¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦
¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦
¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
