2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом
Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам - больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам - детям в возрасте от 1 года до 15 лет. Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (табл. 3).
Таблица 3 Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN
Выборка
Количество детей в семье
Всего
1
2
3
4
5
Полные семьи (изучены оба родителя и дети)
19(57)
0
1(7)
20(64)
Неполные семьи (изучен один родитель и дети)
16(32)
1(3)
17(35)
Нет данных о родителях
5(10)
Примечание. В скобках указано количество индивидов.
Часть пробандов-детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов-детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст - 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст - 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования
Клинико - эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания.
Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта "Унифицированный носитель информации", содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате Microsoft Excel.
2.2.2 Молекулярно - генетические методы анализа полиморфизма генов
Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов - кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) - трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т - консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A - транзиция в 13 интроне и D543N - неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4).
Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20° С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).
Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы ("Сибэнзим", "Медиген", Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа "Эппендорф", наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах "MJ Rеsearch" (США) и "БИС 108" (Россия-Новосибирск).
Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой - производителем ("Сибэнзим", Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
Таблица 4Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN
Ген
Полиморфизм
Выборка больных туберкулезом
Выборка здоровых индивидов
NRAMP1
469+14G/C
279
137
D543N
278
139
1465-85G/A
135
274C/T
299
116
IL12B
1188А/С
129
VDR
B/b
293
108
F/f
298
113
IL1B
+3953A1/A2
301
IL1RN
VNTR
140
Полимор-физм
Структура праймеров
tо отжига прай-меров, оС
Фермент рестрик-ции
Продукты гидролиза, п. н.
Литература
Аллель «дикого» типа
Мутантный аллель
5’-tgccaccatccctatacccag -3’ 5’-tctcgaaagtgtcccactcag -3’
60
Mnl I
167;37;12 bp
102;65;37;12 bp
Liu J. et al., 1995
5’-tctctggctgaaggctctcc -3’ 5’-tgtgctatcagttgagcctc - 3’
Apa I
624 bp
455;169 bp
5’-gcaagttgaggagccaagac -3’ 5’-acctgcatcaactcctcttc -3’
Bsе 1I
142;75;24 bp
102;75;40;24 bp
5’-gcatctccccaattcatggt -3’ 5’-aactgtcccactctatcctg -3’
Bme 18I
126;79;39 bp
201;39 bp
IL12
A1188C
5’-ttctatctgatttgcttta -3’ 5’-tgaaacattccatacatcc -3’
43
Taq I
233 bp
165;68 bp
Hall M. A. еt al., 2000
5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’ 5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’
Pct I
813 bp
505;308 bp
Wilkinson R.J. et al., 2000
5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’ 5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’
Fok I
267 bp
197;70 bp
5’-gttgtcatcagactttgacc-3’ 5’-ttcagttcatatggaccaga-3’
58
220 bp
148; 72 bp
Wilkinson R.J. et al., 1999
5’-tcctggtctgcaggtaa-3’ 5’-ctcagcaacactcctat-3’
А1-410 п.о. (4 повтора); А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов); А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов)
Tarlow J.K. et al., 1993
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20