Таким чином, з допомогою методу ХТШС нами виявлено і доведено, що безпосередньо дисульфірам не утворює сполук з катіонами металів, а лише його метаболіт - диетилдитіокарбамінат, який має інше значення Rf в порівнянні з дисульфірамом. Однак, сам диетилдитіокарбамінат на хроматографічній пластинці в УФ-світлі, на відміну від дисульфіраму, виявляється у вигляді плям з слабкою рожево-фіолетовою флуоресценцією.
Сучасний рівень розвитку науки вимагає використання високочутливих методів аналізу, які дозволяють визначати мікрокількості досліджуваних речовин. Тому широкого застосування набули оптичні методи аналізу, які базуються на взаємодії променевої енергії з аналізуючою речовиною. До цих методів належать фотометричні методи (спектрофотометрія і фотоелектроколориметрія).
Метод спектрофотометрії базується на вибірковому вбиранні монохроматичного випромінювання у видимій, ультрафіолетовій та інфрачервоній ділянках спектру. Вибірковий характер вбирання світла залежить від природи речовини, що дозволяє проводити її якісний і кількісний аналіз.
Цей метод також використовується у фармації, зокрема у фармацевтичному та в хіміко-токсикологічному аналізах, оскільки в ньому повністю реалізується закон Бугера-Ламберта-Бера [3, 4, 5, 7, 15, 22, 40, 48, 56].
В своїх дослідженнях ми також користувались цим методом, але відтепер фотоелектроколориметри є майже в усіх дослідних лабораторіях, бо в десятки разів дешевші за спектрофотометри, а за можливостями і точністю майже не уступають останнім та мають значні переваги за простотою користування.
Тому нами розроблено надійний фотоелектроколориметричний метод кількісного визначення пролонгу "Тетлонг-250" в поєднанні з ХТШС у біологічному матеріалі. Дослідження полягає у відповідній підготовці проби біологічного матеріалу (крові, сечі або органів трупа) стосовно вимог та обробці хроматограм з метою ізоляції метаболіту від залишку димексиду, який гальмує (нами досліджено!) утворення диетилдитіокарбамінатного комплексу з паладієм.
З цією метою органи трупа подрібнюють, а кров або сечу розводять водою удвоє, і екстрагують диетилдитіокарбамінат разом із залишком дисульфіраму сумішкою хлороформу з етанолом (5:
1) 5 разів по 10 мл. Витяжки з окремого біоматеріалу об’єднують, промивають таким самим об’ємом води і центрифугують. Нижній шар відділяють і випаровують на водному огрівнику досуха; залишок при слабкому нагріванні розчиняють в 3-4 мл етанолу, концентрують і кількісно переносять на старт хроматографічної пластинки [51, 52].
При відпрацюванні методики нами виявлено інгібуючу дію на оптичну густину утвореного комплексу слідів димексиду в досліджуваній пробі.
Для попередження цього явища пластинки після хроматографування підсушують спочатку на повітрі, а потім у вакуумному ексикаторі не менше 6 год. і таким чином позбуваються всіх слідів димексиду. Опісля плями з диетилдитіокарбамінатом знімають, екстрагують нагарячо етанолом (3 рази по 1,5 мл), фільтрують, доводять етанолом об’єм до 4,9 мл і додають 0,1 мл 0,5% етанолового розчину PdCl2, перідично збовтують протягом 30 хв. Через 30 хв. реакція комплексоутворення досягає найбільшої стабільності (протягом 20 хв) по оптичній густині D (перевіряють за еталонами-свідками), яку й вимірюють при світлофільтрі з λ = 315 нм з товщиною шару в 0,5 см напроти чистого етанолу (5 мл) з реактивом (0,1 мл 0,5% етанолового розчину PdCl2, що служить розчином порівняння.
Для визначення кількості дисульфіраму за його метаболітом попередньо будують калібрувальний графік залежності оптичної густини D від концентрації препарату С в мкг/мл. З цією метою готують стандартний 30,8 мг% -й розчин диетилдитіокарбамінату натрію у воді, який еквівалентний 20 мг% -ій концентрації дисульфіраму (коефіцієнт перерахунку 1,54), тобто такий, що відповідає вмісту 200 мкг/мл дисульфіраму.
Для цього на аналітичних терезах відважують 30,8 мг диетилдитіокарбамінату натрію, кількісно переносять у мірну колбу об’ємом 100 мл і, розчиняючи його, доводять об’єм розчину до мітки. Перемішують. З цього розчину готують серію розведених розчинів для утворення комплексної сполуки з PdCl2 в ряд мірних пробірок, відбираючи в них прокаліброваними градуйованими піпетками на 0,1 мл, 1 мл і 5 мл необхідні об’єми стандартного розчину, що відповідає певній концентрації дисульфіраму в мкг/мл: 0,025 мл (1 мкг/мл); 0,05 мл (2 мкг/мл); 0,1 мл (4 мкг/мл); 0,15 мл (6 мкг/мл); 0,25 мл (10 мкг/мл); 0,5 мл (20 мкг/мл); 0,75 мл (30 мкг/мл); 1,0 мл (40 мкг/мл); 1,25 мл (50 мкг/мл); 1,5 мл (60 мкг/мл); 1,75 мл (70 мкг/мл); 2,0 мл (80 мкг/мл); 2,25 мл (90 мкг/мл); 2,5 мл (100 мкг/мл); 2,85 мл (110 мкг/мл).
Опісля в кожну пробірку додають по 0,1 мл 0,5% водного розчину PdCl2 і доводять загальний об’єм кожної пробірки до 5,0 мл етанолом. Пробірки закривають і періодично збовтують протягом 30 хв., після чого проводять вимірювання оптичної густини цих розчинів з допомогою фотоелектроколориметра "КФК-2" в кюветі 0,5 см при світлофільтрі з λ = 315 нм навпроти розчину порівняння, що містить 0,1 мл 0,5% розчину PdCl2 в 5 мл спирту. Визначення D кожного розчину проводять тричі і беруть середнє значення, яке заносять в таблицю 2. За цими даними будують калібрувальний графік залежності оптичної густини D розчинів дисульфіраму від концентрації його в мкг/мл, представлений на рисунку 1. Дані таблиці і калібрувального графіка свідчать, що оптична густина D паладієвого комплексу диетилдитіокарбамінату підпорядковується закону Бугера-Ламберта-Бера в межах концентрацій від 1 до 100 мкг дисульфіраму в 1 мл розчину.
Таблиця 2
Залежність оптичної густини D калібрувальних розчинів диетилдитіокарбамінат. Pd2+ (в переведенні на дисульфірам) від концентрації "С" при λ = 315 нм в кюветі 0,5 см
Дисульфірам "С" в мкг/мл
D1
D2
D3
Dсер
0
1
0,01
0,00
2
0,03
0,02
4
0,04
6
0,05
10
0,1
0,11
20
0,21
0,2
30
0,29
0,3
0,28
40
0,4
0,41
50
0,48
0,5
0,49
60
0,6
70
0,68
0,69
80
0,8
90
0,88
0,9
0,89
100
1,0
110
1,05
1,02
1,04
Дослідження препарату ґрунтується на здатності його основного метаболіту - диетилдитіокарбамінату утворювати оптичні комплекси у водно-спиртових речовинах з Рd2+ і вимірювання їх оптичної густини в УФ-ділянці світла.
При відпрацюванні методики було перевірено також вплив слідів димексиду в пробі біологічного матеріалу (крові, сечі, органах трупа) на оптичну густину утвореного комплексу, оскільки димексид гальмує його утворення. Вимірювання оптичної густини всіх контрольних проб (без димексиду) свідчить про відсутність будь-якої суттєвої різниці в значеннях „D” (0,000-0,015) яка залежиться тільки від якості обробки хроматограм.
В результаті проведених експериментів встановлено, що вимірювання оптичної густини D водно-спиртових паладієвих комплексів диетилдитіокарбамінату необхідно проводити не раніше 30 хв. від початку реакції, тобто під час найбільшої стабільності утвореного комплексу.
а) весь об‘єм добової сечі розводять водою до подвійного об‘єму і в ділильній лійці екстрагують дисульфідам в формі його метаболіту - диетил дитіокарбамінату сумішкою хлороформу з етанолом (5:
1) 5 разів по 6 мл за методикою Farago A. чи Домара [12, 41, 61]. Витяжки об‘єднують і випаровують на водному огрівнику досуха.
б) пробу крові розводять водою до 100 мл і екстрагують діетиловим ефіром 5 разів по 6 мл методикою [60] аналогічно.
в) органи трупа подрібнюють і екстрагують 5 разів сумішкою хлороформу з етанолом (1:
1) по Стас-Отто, чи за методикою Farago А. [11, 59], періодично збовтуючи в ділильній лійці на протязі 2-х годин. Витяжки випаровують, а залишок розчиняють в 600 спирті і видаляють жир, промиваючи його ефіром. Спиртовий залишок випаровують на водному огрівному досуха.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
