Рефераты. Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию

Рисунок 17. А. ДСН-электрофорез фракций

1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – молекулярные стандарты массы белков, 3 – суммарный белок МХ. Б. Вестерн-блот анализ: 1 – очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 – суммарный белок МХ.

Показано, что полученные в работе антитела специфически связываются только с белком с м.м. 55 кДа, и не вязываются ни с одним из массы белков, находящихся в МХ (Рис.19). Таким образом, в работе были получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа.

Этим же методом было установлено, что поликлональные антитела на исследуемый белок-канал, полученный из МХ печени крысы, не взаимодействует с той же концентрацией аналогичного белка с м.м. 55 кДа, выделенного тем же методом из МХ сердца крысы. Данный факт указывает на то, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа тканеспецифичен.

5.4.2 Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа

Полученные антитела к АТФ-чувствительному К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы, использовали в качестве ингибитора АТФ-зависимого транспорта ионов калия в МХ печени крысы. Для этого, полученные очищенные и концентрированные антитела (иммуноглобулины G (IgG)) кроликов (см. «Материалы и методы»). Контролем служили очищенные IgG сыворотки крови Интактных (неиммунизированных) кроликов. Кроме того, в качестве контроля использовались антитела к белку с м.м. 55 кДа, подвергнутые кипячению в течение 5 минут. Ранее было показано, что такая процедура ведет к потере белком активности. IgG контрольных животных получали тем же способом, что и IgG рабочей сыворотки. В ходе выделения и очистки IgG титр антител и сродство к белку-каналу с м.м. 55 кДа существенно не изменяется. Степень чистоты выделенных из сыворотки IgG определяли методом ДДС-ПААГ электрофореза [Laemmli, 1979] (см. «Материалы и методы»).

Очищенные фракции IgG, выделенные из иммунизированных и интактных животных, использовали для ингибирования АТФ-зависимого выхода ионов К+ из МХ в присутствии ДНФ, отражающего работу митоКАТФ, и энергозависимого входа ионов К+ в МХ. Все эксперименты проводились при термостатировании (26°С) и постоянном перемешивании. После 1.5-2 минут преинкубации антител с митохондриями транспорт ионов К+ индуцировали ДНФ (при исследовании выхода К+ из МХ К+-селективным электродом) или субстратом дыхания (при определении энергозависимого входа К+ в МХ). Для повышения эффективности взаимодействия IgG с внутренней мембраной МХ создавались гипотонические условия. На рисунке 6 представлена концентрационная зависимость степени ингибирования выхода ионов К+ из МХ печени крысы в присутствии разобщителя (ДНФ). Ингибирующий эффект антител наблюдается только в случае добавления в среду инкубации МХ очищенных интактных IgG к АТФ-зависимому К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из печени крысы. Степень ингибирования зависела от концентрации IgG и времени преинкубации.

Рисунок 18. Ингибирование АТФ-зависимого ДНФ-индуцированного выхода К+ из МХ печени крысы антителами на АТФ-чувствительный К+ белок-канал с м.м. 55 кДа. Кi = 0.170+0.07 мг IgG/мг белка МХ

Максимальное ингибирование, наблюдавшееся в данных экспериментах составляло 83%. Константа полумаксимального ингибирования (Кi) составила 0.170+0.07 мг IgG/мг белка МХ (Рис. 20).

Антитела к белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы, ингибируют также энергозависимый вход ионов К+ (Рис. 21).

Рисунок 19. Ингибирование энергозависимого входа ионов К+ в МХ печени крысы антителами на белок с м.м. 55 кДа

Следует отметить, что IgG контрольной сыворотки и IgG, инактивированные кипячением, не влияли ни на ДНФ-индуцированный выход калия из МХ, ни на энергозависимый вход ионов (Таблица 9). Кроме того, антитела, полученные на АТФ-зависимый К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, выделенный из МХ печени крысы, не блокировали АТФ-чувствительный К+ транспорт в МХ сердца крысы, при использовании обоих методов исследования (Таблица 9).

Таблица 3. Процент максимального ингибирования АТФ-зависимого К+ транспорта в МХ печени и сердца крыс антителами, полученными на белок с м.м. 55 кДа, выделенный из МХ печени крысы.

Образец	% максимального ингибирования АТФ-зависимого входа К+ в МХ, измеренного методом спектрофотометрии	% максимального ингибирования ДНФ-индуцированного выхода К+ из МХ, измеренного с помощью К+-селективного электрода
МХ печени	68	80
МХ сердца	1.5	2
МХ печени + АТ преимунной сыворотки	0	0
МХ сердца + АТ преимунной сыворотки	0	0
МХ печени + АТ, инактивированные 5-тиминутным кипячением	1	1.5

В работе также определяли влияние полученных антител на параметры дыхания МХ. Ни контрольные IgG, ни IgG, специфические к белку-каналу с м.м. 55 кДа (Рис. 22), ни инактивированные IgG, не оказывали заметного влияния на дыхание МХ в присутствии субстрата и АДФ.

Отсутствие подобного влияния связано, по-видимому, с тем, что в интактных МХ, в которых не индуцировали транспорт К+, роль данного иона в процессе дыхания незначительна.

Таким образом, в работе получены специфические поликлональные антитела на выделенный из МХ печени крысы белок с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в БЛМ АТФ-ингибируемые К+-селективные каналы. Данные антитела блокируют АТФ-зависимый вход К+ в нативные МХ и ДНФ-индуцированный, ингибируемый АТФ, выход этого иона из МХ. Следует отметить, что исследуемые антитела не влияют на другие параметры функционирования МХ, в том числе, на дыхание. Полученные результаты доказывают, что белок с м.м. 55 кДа действительно участвует в формировании АТФ-зависимого калиевого канала внутренней мембраны МХ и, по всей видимости, является его канальной субъединицей.

5.5 Электронная микроскопия МитоКАТФ канала

Для более точного доказательства локализации белка с м.м. 57 кДа во внутренней мембране митохондрий было проведено электронно-микроскопическое исследование срезов тканей печени и сердца с использованием АТ на белок с м.м. 55 кДа. Идентификации эндогенного белка-канала и его связывание с АТ проводились с помощью вторичных антител, меченых коллоидным золотом (диаметр гранул – 10 нм). Как видно из рисунка 21, такого рода гранулы золота локализуются во внутренней мембране митохондрий как печени (Рис.21а), так и сердца (Рис.21б), причем в сердце их больше, что соответствуют данным о большей плотности митоКАТФ каналов в митохондриях сердца. Локализуются эти каналы ближе к месту контакта внутренней и внешней мембраны митохондрий, что особенно проявляется с митохондриях сердца (Рис.21б).

Рис.21а. Электронная микроскопия среза гепатоцита крысы. а - Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку. Черные гранулы (указаны стрелкой) -сайты локализации К+-транспортирующего белка с м.м. ~ 55 кДа в митохондриях.

Рис.21 б. Митохондрии и саркоплазматический ретикулум (СР) на срезе кардиомицитов крысы. Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку. Черные гранулы- сайты локализации К+-транспортирующего белка с м.м. ~ 57 кДа в митохондриях, а также сайты связывания антител с СР.

Такие же гранулы (Рис.21А) обнаружены и в ретикулюме, особенно в месте его слияния с мембраной митохондрий, что подтверждает выявленную нами методом MS-MALDI-TOF/TOF – анализа общность в структуре изучаемого белка с микросомах кальретикулином (м.м. 55 кДа).

Рис.22. Электронная микроскопия эндоплазматический ретикулум (ЭР) на срезе гепатоцитов крысы. Срезы инкубированы с антителами к митохондриальному К+-транспортирующему белку.

В контрольных экспериментах, где были использованы только вторичные АТ, гранулы коллоидного золота не были выявлены. Использование антител к канальной субъединице цитоплазматического КАТФ канала – KIR6.2 не обнаружило наличия этого белка-канала в митохондриях (Рис.23, 24).

Рис.23. Электронная микроскопия среза гепатоцита крысы. Контроль (Первичные антитела заменены буфером).

Рис.24. Митохондрии и саркоплазматический ретикулум (СР) на срезе кардиомицитов крысы. б - Контроль (Первичные антитела заменены буфером)

Т.о., полученные результаты показали отсутствие общности в структуре KIR6.2 и изучаемого нами митохондриального белка-канала.

Приведенные в настоящей работе данные позволяют подтвердить, высказанное нами ранее предположение, что белок с м.м. 55 кДа относится к митохондриальной системе АТФ-зависимого транспорта калия и вместе с известными в литературе глибенкламид-связывающими белками митохондрий входит, вероятно, в состав митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, являясь его канальной субъединицей (митоKIR).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению роли митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (митоКАТФ) в защите сердца от ишемии, формировании адаптации животных к гипоксии, а также исследованию структурной организации данного канала.

В представленной работе также была изучена роль митоКАТФ канала в формировании адаптации животных к кислородному голоданию. Для этого использовали крыс, разделенных на две группы (низкоустойчивые и высокоустойчивые) по способности выдерживать подъем на высоту в 11500 м. Кроме того, в работе низкоустойчивые животные, были адаптированы к недостатку кислорода прерывистой нормобарической гипоксической тренировкой.

Показано, что у высокоустойчивых животных митоКАТФ канал работает эффективнее, а показатели сопряжения дыхательной цепи были выше, чем у низкоустойчивых. Адаптация низкоустойчивых животных к гипоксии сопровождается сопряжением дыхательной цепи и активацией митоКАТФ канала. В то же время, поскольку набухания, которое, как предполагается, должно следовать за активацией митоКАТФ, не наблюдается, так как количество калия в митохондриях, по нашим данным, не увеличивается, а даже снижается, вероятнее всего, активируется также и система выхода калия из митохондрий (система К+/Н+-обменника).

Задачей настоящей работы было также выяснение структурной гомологии белка с м.м. 55 кДа, формирующего канальную субъединицу митоКАТФ канала [Mironova et al., 2004] аминокислотным последовательностям известных белков. Для этого проводился MS-MALDI-TOF/TOF анализ, с последующей обработкой результатов. Было показано, что белок с м.м. 55 кДа обладает высокой (54%) степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов.

Полученный результат вызвал необходимость дополнительного исследования принадлежности исследуемого белка-канала к семейству митохондриальных белков. Для этого на 55 кДа белок, выделенный из митохондрий печени крысы и формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-чувствительный калиевый канал, были получены специфические поликлональные антитела. Вестерн-блот анализ с полученными антителами позволил выявить тканеспецифичность изучаемого белка-канала. Был также проведен ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях, результаты которого показали, что АТ на белок из митохондрий печени крыс ингибировали этот транспорт в митохондриях печени, но не сердца крыс. При этом они не влияли на показатели сопряженного дыхания митохондрий печени крыс. Следовательно, белок с м.м. 55 кДа действительно относится к системе АТФ-чувствительного входа К+ в митохондрии. Для более точного доказательства локализации белка с м.м. 57 кДа во внутренней мембране митохондрий было проведено электронно-микроскопическое исследование срезов тканей печени и сердца с использованием АТ на белок с м.м. 55 кДа. Которое так же подтверждает высказанное ранее предположение.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10