В качестве системы электрогенного транспорта К+ в МХ предлагались следующие варианты: 1) подвижный переносчик или канал [Jonston and Griddle, 1978; Panov et al., 1980; Jung et al., 1982]; 2) электродиффузное движение через гидрофильные поры и 3) вход калия с участием белковых транспортных систем, которые помимо своей основной функции, могут осуществлять транспорт К+ [Brierly, 1980, 1983].
1.1.3 Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ
В настоящее время в литературе в качестве транспортных систем, осуществляющих электрогенный транспорт калия в МХ, рассматриваются следующие структуры: 1) АТФ/АДФ-антипортер или аденинуклеотидтранслоказа (АНТ) [Panov et al., 1980; Le Quoc et al., 1988] и 2) специфические белки, которые образуют во внутренней мембране МХ канал для электрогенного входа ионов калия [Миронова и др., 1981; Diwan et al., 1988; Paucek et a., 1992]. В первом случае предполагается, что АНТ, помимо основных функций, может работать как система электрофоретического транспорта ионов калия в МХ при действии на МХ субмикромолярных концентраций ионов кальция, и как неспецифическая пора для низкомолекулярных соединений при повреждении МХ высокими концентрациями Ca2+ [Jung and Brierley, 1981; 1982; Halestrap et al., 1986].
Что касается специфических белков, следует отметить, что в лаборатории Мироновой в 1981 г. методом водно-этанольной экстракции из МХ сердца быка был выделен и очищен белок с м.м. 55 кДа, который при реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) образовывал К+-селективные каналы проводимости [Миронова и др., 1981], которые, как было показано позднее, ингибируются физиологической концентрацией АТФ и глибенкламидом, и относятся к семейству АТФ-чувствительных калиевых каналов [Миронова и др., 1996 (I); Mironova et al., 1999]. Структура митохондриального КАТФ канала не определена [Paucek et al., 1992].
Диван с соавторами, используя детергент Тритон Х-100, из МХ мембраны печени крыс выделили белок с м.м. 53 кДа [Diwan et al., 1988]. Реконструировав его в липосомы, авторы показали, что этот белок также обладает свойствами, характерными для К+ унипортера.
Известно, что в МХ помимо системы электрогеннного входа К+ существует система электронейтрального выхода К+ в обмен на Н+ [Garlid and Paucek, 2003]. При этом внешняя МХ мембрана не препятствует дальнейшему обмену небольшими ионами с цитоплазмой.
Система электрогенного входа калия и электронейтрального К+/Н+-обменника образуют К+ цикл МХ (Рис.1).
Рис. 1. МХ калиевый цикл по Garlid and Paucek, 2003. ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство; Фн – неорганический фосфат.
Электрогенный выброс протонов электрон-транспортной системой генерирует мембранный потенциал, который, в свою очередь, стимулирует диффузию К+ в матрикс МХ («утечка калия» или К+ leak) и вход иона, опосредованный неким специфическим калиевым каналом. Такой обмен Н+ на К+ подщелачивает матрикс, вызывая вход фосфата по электронейтральному Фн-Н+ симпортеру (Фн – неорганический фосфат) (Рис.1).
Вход К+ сопровождается накоплением осмотически облигатной воды, что проявляется в набухании МХ. Излишнее их набухание может угрожать целостности этих органелл, следовательно, избыток К+ необходимо удалять. Эту функцию выполняет белок с м.м. 82 кДа - К+/Н+-антипортер [Brierley G., 1976; Garlid K., et al., 1980; 1988]. Следует отметить, что вход К+ путем диффузии слишком мал, чтобы существенно влиять на изменение объема матрикса МХ. Интенсивный вход калия в МХ обеспечивается специфическими белками, осуществляющими электрофоретический вход К+ в МХ [Mironova G., 1981; Diwan J., et al., 1988; Paucek et al., 1992].
Предполагается, что основное физиологическое значение систем транспорта К+ в МХ связано с регуляцией объема МХ матрикса. Объем МХ определяется калиевыми токами через внутреннюю мембрану. Когда вход и выход К+ находятся в равновесии, калиевые потоки определяются электронейтральным током анионов и осмотически облигатной воды [Garlid, 1988]. Так как концентрация ионов калия в матриксе и в цитоплазме практически одинаковая, транспорт калия мало влияет на матриксную концентрацию калия, но может иметь большое влияние на объем МХ. Небольшое нескомпенсированное увеличение входа К+ в МХ может удваивать их объем в течение 1-2 минут [Garlid, 1979]. В свою очередь, увеличение матриксного объема стимулирует активность дыхательной цепи, что было показано на МХ сердца и печени [Nichols and Lindberg, 1972; Halestrap, 1989]. Окисление жирных кислот также чувствительно к изменению объема матрикса [Halestrap, 1987].
Увеличение в МХ концентрации К+ и последующее изменение их объема имеет значение и в регуляции митохондриальных процессов у зимоспящих животных [Fedotcheva et al., 1985; Бакеева и Брустовецкий, 1993], а также при адаптации животных к холоду [Nedergraard and Cannon, 1987]. В ряде работ установлено, что in vivo, гормон, участвующий в регуляции теплопродукции (тироксин), активирует системы электрогенного транспорта К+, вызывая низкоамплитудное набухание МХ [Halestrap, 1987; Shears an Brouk, 1980]. В нашей лаборатории, было показано, что активность системы электрогенного транспорта ионов калия прямо коррелирует с интенсивностью термогенеза [Федотчева и др., 1984; Миронова и др., 1986], что непосредственно связано с увеличением содержания ионов калия в МХ бурой жировой ткани и печени [Скарга, 1994]. Активацию транспорта калия при выходе животного из спячки, связывают с активацией футильного цикла К+ в МХ, приводящей к увеличению теплопродукции, до начала синтеза АТФ в МХ [Миронова и др., 1986].
Обнаружено также, что митоКАТФ канал играет существенную роль в нормальной физиологии миокарда, регулируя объем митохондрий и продукцию активных форм кислорода (АФК) [Garlid et al., 2003a].
В последнее время интерес ученых к митоКАТФ каналу вызван обнаружением его роли в защите сердца от инфаркта. Исследования были стимулированы открытием феномена кардиопротекторного действия прерывистой гипоксии, приводящей к активации митоКАТФ [Murry et al., 1986]. Установлено, что фармакологические активаторы митоКАТФ канала предохраняют сердце от ишемических повреждений [Garlid et al., 1997].
1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы
К+ каналы, активность которых ингибируется физиологическими концентрациями АТФ впервые были обнаружены в цитоплазматической мембране кардиомиоцитов [Noma, 1983]. С тех пор, аналогичные каналы были найдены в β клетках поджелудочной железы [Dunne and Petersen, 1991], в скелетной мускулатуре [Spruce et al., 1985; Woll et al., 1989], в нервных клетках [Jonas et al., 1990] и гладких мышцах [Standen et al., 1989]. Активность АТФ-чувствительных калиевых каналов (КАТФ каналов) связана с уровнем биоэнергетического метаболизма клетки (концентрацией АТФ) и электрическими свойствами возбудимости плазматической мембраны. Микромолярные концентрации АТФ и сульфонилмочевины – класс гипогликемических соединений, использующихся при лечении диабета, регулируют активность всех представителей семейства КАТФ каналов [Ashcroft et al., 1989]. Концентрация кальция и изменение мембранного потенциала практически не влияют на активность этих каналов [Ashcroft and Ashcroft, 1990]. В то же время, в кортикальных и гипоталамических нейронах КАТФ каналы [Ashford et al., 1989; Ashford et al., 1988] менее чувствительны к АТФ (для их ингибирования нужны миллимолярные концентрации). В эпителиальных клетках (назальные полипы) также были обнаружены КАТФ каналы с низкой чувствительностью к АТФ, но активирующиеся микромолярными концентрациями Ca2+ [Kunzelmann et al., 1989]. При этом, все вышеперечисленные каналы высокоселективны для ионов К+.
В МХ мембране также были обнаружены АТФ-зависимые К+ каналы. Так, в 1991 г. впервые с использованием метода петч-кламп [Inoue et al., 1991] на митопластах было показано, что во внутренней мембране МХ присутствуют высокоселективные по К+ каналы с невысокой проводимостью. Обнаружено, что каналы могут обратимо ингибироваться АТФ, а так же 4-аминопиридином и специфическим ингибитором цитоплазматического КАТФ канала – глибенкламидом с матриксной стороны [Inoue et al., 1991]. Однако, как было сказано выше, еще в 1981 году в лаборатории проф. Мироновой во внутренней мембране МХ был обнаружен К+-селективный АТФ-ингибируемый канал [Миронова и др., 1981; 1996; 1997; 1999], принадлежащий к семейству КАТФ каналов [Paucek et al., 1992]. Данный канал имеет те же характеристики проводимости, что и канал, обнаруженный методом пэтч-кламп. В настоящее время он интенсивно изучается, поскольку играет важную роль в функционировании клетки. Однако вопрос о его структуре требует дальнейших исследований.
1.2 АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны
К настоящему времени КАТФ каналах плазматической мембраны хорошо изучены. Изначально их классификация велась по величине проводимости одиночных каналов [Ashcroft and Ashcroft, 1990], а позднее, с развитием молекулярно-биологических методик, по аминокислотному составу белковой молекулы канала [Yokoshiki et al., 1998].
1.2.1 Структурная организация цитоплазматического АТФ-зависимого калиевого канала
Молекулярно-биологические и электрофизиологические исследования последних лет позволили определить структуру цитоКАТФ канала. Исследуемый канал состоит из двух белков: KIR – inward rectifying K+ channels, формирующий пору канала, и SUR – sulphonyl urea receptor, регуляторная субъединица, придающая каналу чувствительность к модуляторам. SUR-субъединица содержит нуклеотидсвязывающие участки, локализующиеся на цитоплазматической стороне, а также участки связывающие активаторы калиевых каналов (potassium channel activators, PCOs) и MgАДФ. Каналы подсемейства KIR6.0 сами обладают чувствительностью к АТФ. Роль SUR заключается, вероятно, в облегчении доступа АТФ к АТФ-связывающему участку KIR [Tucker et al., 1997; Yokoshiki et al., 1998]. В настоящее время механизмы молекулярного взаимодействия KIR и SUR окончательно не выяснены.
Результаты исследования электрофизиологических свойств нативных КАТФ каналов позволяют предположить, что они принадлежат к классу калиевых каналов внутреннего выпрямления (KIR). В 1993 году на многие KIR каналы (KIR1.1 [Ho et al., 1993], KIR2.1 [Kubo et al., 1993], KIR3.1 [Dascal et al.,1993]) были получены клоны. Их выделили в отдельное подсемейство KIR-каналов (KIR1.0-6.0), основанное на унифицированной номенклатуре [Chandy and Gutman, 1993]. Гидрофобные участки клонированных KIR каналов содержат два мембранопересекающих сегмента М1 и М2, образующих пору. Подобно потенциалзависимым К+ каналам, KIR каналы, вероятно, формируют тетрамер [Doupnik et al., 1995; Salkoff and Jegla, 1995; Nichols et al., 1996; Nichols and Lopatin, 1997].
Также был клоирован регуляторный белок, содержащий участок, связывающий сульфонилочевину (SU-связывающий сайт) [Aguillar-Bryan et al., 1995; Thomas et al., 1995; Inagaki et al., 1996; Isomoto et al., 1996]. Клонированные регуляторные белки получили название SUR. SUR содержит два нуклеотидсвязывающих участка (NFBs) с цитоплазматической стороны. N-конец находится с внешней стороны мембраны и содержит два домена, предположительно из 9 и 4 пронизывающих мембрану спиралей (Рис.2) [Yokoshiki et al., 1998].
Рис. 2. Схематическое изображение цитоплазматического КАТФ канала как комплекса KIR и SUR [Yokoshiki H. et al., 1998]
Считается, что нативный КАТФ канал представляет собой комплекс из четырех KIR6.x и четырех SUR субъединиц [Clement et al., 1997]. Различные типы регуляторных субъединиц, SUR1, SUR2A и SUR2B, обнаружены, соответственно, в поджелудочной железе, сердце и гладких мышцах [Ammala et al., 1996; Inagaki et al., 1996; Yamada et al., 1997].
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
