1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ
В 1981 г. из внутренней мембраны МХ был выделен К+-селективный канал (митоКАТФ) [Миронова и др., 1981], который ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)]. В 1991 г. этот канал был впервые обнаружен во внутренней мембране МХ методом пэтч-кламп [Inoue et al., 1991], позднее появились аналогичные работы других исследователей [Nakae et al., 2003; Fikret et al., 2004; Dahlem et al., 2004; Bednarczyk et al., 2005]. В настоящее время канал активно изучается, поскольку обнаружено, что он участвует в адаптации организма к гипоксии [Garlid et al., 1997]. В настоящее время основными методами выделения АТФ-ингибируемого МХ калиевого канала (митоКАТФ) является метод водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; Миронова и др., 1996 (I)] и солюбилизация белка-канала из мембраны Тритоном Х-100 с последующей очисткой ионообменной хроматографией. При этом митоКАТФ канал выделяют в виде белка с молекулярной массой 55 кДа [Mironova et al., 2004].
1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала
Так как митоКАТФ имеет ряд общих свойств с цитоКАТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Mironova et al., 1999] и состоит из канальной субъединицы [Mironova et al., 2004] и регуляторной [Bajgar et al., 2001]. Белок с м. м. 55 кДа, выделенный из внутренней мембраны МХ печени крысы, является, по-видимому, канальной субъединицей митоКАТФ. При встраивании в БЛМ этот белок формирует АТФ-зависимые каналы (митоKIR). Активность этих каналов не блокируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоКАТФ 5-ГД, и не активируется кромакалимом и ддиазоксидом. Однако эти препараты влияют на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных МХ, где есть обе субъединицы канала [Mironova et al., 2004].
МитоКАТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной масой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, был назван митоKIR (от англ. Inward rectifying) [Mironova et al., 2004] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (от англ. sulphonylurea) (Рис. 3) [Mironova et al., 1999; Bajgar et al., 2001].
Кi для АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR выше, чем в интактных МХ и Mg2+ для этого ингибирования не требуется. Тогда как для АТФ-ингибирования канала, локализованного в интактных МХ, присутствие магния было необходимо [Mironova et al., 2004]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевин на цитоKIR и целый цитоКАТФ [Tucker et al., 1997]. Известно, что основной участок связывания АТФ в цитоКАТФ локализован на канальной субъединице. Регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [Tucker et al., 1997].
Рис.3. Рабочая модель структуры МХ АТФ-зависимого К+ канала [Mironova et al., 2004]
Приведенные выше результаты исследований митоКАТФ подтверждают предположение о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей целого митоКАТФ. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с м.м. 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [Bajgar et al., 2001].
В то же время, результаты исследований, проведенных на МХ сердца, с использованием антител на Kir6.1 и Kir6.2, а также на SUR1 и SUR2, показали, что в МХ кардиомиоцитов присутствуют Kir6.1 и Kir6.2, но нет ни SUR1, ни SUR2. Однако в них обнаруживается SUR2-подобный белок, который, возможно, является сплайсированным вариантом SUR2 [Lacza et al., 2003 (I)].
При исследовании митоКАТФ мозга, близкого по структуре к цитоКАТФ [Lacza et al., 2003 (II)], с использованием АТ к KIR6.1 и KIR6.2, а также SUR1 и SUR2 субъединицам цитоКАТФ было показано, что очищенные МХ мозга содержат преимущественно KIR6.1 и, в меньшей степени, KIR6.2 и не содержат SUR1 и SUR2. Согласно выводам авторов, в формировании митоКАТФ мозга участвует укороченный вариант SUR2 или белок, подобный по структуре SUR2. Кроме того, показано, что МХ мозга содержат в 8 раз больше KIR6.1 и SUR2-подобного белка, по сравнению с общим белком ткани мозга, что подтверждает локализацию этих белков в МХ [Lacza et al., 2003 (II)]. Тот факт, что м.м. митоKIR мозга несколько ниже (50 кДа), чем у митоKIR печени [Mironova et al., 1999; 2004], предполагает наличие тканевой специфичности в структуре каналов.
Было показано, что при встраивании в липосомы или липидные бислойные мембраны комплекса митохондриальных белков, состоящего из АТФ связывающего кассетного белка-1 (mАВС1 от англ. Mitochondrial binding casset), АТФ-азы, сукцинатдегидрогеназы, аденилаттранслоказы и фосфатного переносчика, в мембране образуются чувствительные к АТФ и глибенкламиду каналы [Ardehali et al., 2004]. Это послужило основой для другого варианта модели субъединичной организации митоКАТФ [Ardehali and O'Rourke, 2005]. Однако нельзя исключить наличие в этом белковом комплексе других митохондриальных белков, включая митоKIR, тем более что белок с м.м. 55 кДа в нём присутствует. Поcкольку этот мультикомплекс в липосомах индуцировал открытие неспецифической Са2+-зависимой поры в присутствие ионов Са2+ [Ardehali et al., 2004], это говорит о возможном загрязнении исследуемого комплекса порином и другими белками. Было показано, что один из белков этого комплекса, а именно mАВС1, играет важную роль в защите клеток миокарда от окислительного стресса [Ardehali et al., 2005]. Однако кардиопротекторное действие этого белка не снималось ингибиторами митоКАТФ - глибенкламидом и 5-НD. Поэтому, по мнению авторов, пока не получено достаточно доказательств для утверждения того, что mАВС1, имеющий, также как и митоКIR, м.м. 55 кДа, является частью митоКАТФ.
Таким образом, вопрос структуры митоКАТФ по-прежнему остается открытым. В связи с чем, в представленной работе была предпринята попытка определить относится ли белок с м.м. 55 кДа, выделяемый из внутренней мембраны МХ методом водно-этанольной экстракции, к системе АТФ-зависимого транспорта К+. Также, был проведен анализ гомологии структуры исследуемого белка последовательностям известных белков.
Глава 2. Модуляторы
2.1 Модуляторы митоКАТФ канала
2.1.1 Метаболические модуляторы митоКАТФ канала
В связи с выраженным кардиопротекторным действием активаторов митоКАТФ в настоящее время во многих лабораториях ведется поиск новых синтетических активаторов канала, которые могут быть потенциальными кардиопротекторами [Ockaili et al., 2002; Kopustinskene et al., 2001]. В нашей лаборатории помимо синтетического донора электронов ДЕБ, который селективно активировал митоКАТФ [Mironova et al., 1999; Mironova et al., 2004], был обнаружен ряд природных, то есть метаболических активаторов этого канала.
Дифосфонуклеотиды
Показано, что дифосфонуклеотиды (АДФ и ГДФ) активируют реконструированную в БЛМ канальную субъединицу (Рис. 2) [Grigoriev et al., 1999; Mironova et al., 1999]. Данные по активирующему действию ГДФ в дальнейшем были подтверждены и другими исследователями [Bednarczyk et al., 2005]. Недавно в нашей лаборатории было показано, что в ряду дифосфонуклеотидов наиболее эффективным является уридиндифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004].
В МХ УДФ (~20 мкМ) активирует митоКАТФ, и эта активация снимается глибенкламидом и 5-ГД (Рис. 4) [Mironova et al., 2004]. Концентрации УДФ, неоходимые для активации реконструированного в БЛМ митоKIR и целого канала в нативных МХ, одинаковы. Следовательно, участок связывания УДФ локализуется на канальной субъединице. Для активации цитоКАТФ нужны значительно большие концентрации этого препарата [Alekseev et al., 1998].
Рисунок 4. Активация УДФ целого митоКАТФ канала в нативных МХ [Mironova et al., 2004]
Ранее на моделях тотальной и регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс было показано, что уридин и УМФ проявляют антиаритмическую активность в отношении реперфузионных аритмий, предупреждают развитие миокардиального станинга при постишемической реперфузии, препятствуя депрессии сократительной функции миокарда и предотвращая развитие контрактуры [Eliseev et al., 1989].
В представленной работе была предпринята попытка определить, обладают ли уридиновые нуклеотиды кардиопротекторным действием и связано ли их влияние с активацией цито- и митоКАТФ каналов на модели искусственного острого инфаркта миокарда.
2.2 Функциональная роль митоКАТФ
Являясь одним из компонентов калиевого цикла МХ, митоКАТФ участвует в поддержании объема МХ матрикса и мембранного потенциала [Garlid, 1998]. В лаборатории проф. Мироновой показано, что активация митоКАТФ играет важную роль при выходе животных из состояния зимней спячки [Fedotcheva et al., 1985; Миронова и др., 1986]. МитоКАТФ участвует также в ингибировании процесса апоптоза клетки, блокируя высвобождение цитохрома С, предотвращая снижение мембранного потенциала и чрезмерное увеличение концентрации Ca2+, сохраняя, таким образом, функции МХ, что было показано на b-клетках поджелудочной железы [Akao et al., 2001], а затем и на церебральных нейронах [Teshima et al., 2003]. Кроме того, митоКАТФ является посредником в процессе регуляции транскрипции некоторых генов. Его активация вызывает небольшое увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) [Chandel et al., 1998].
При патологии активация митоКАТФ частично востанавливает мембранный потенциал, стимулируя дальнейший перенос протонов, ингибируя накопление внутримитохондриального кальция и предотвращая распад энергетических фосфатов путем создания оптимального для синтеза АТФ электрохимического градиента [Szewczyk, 1996; Xu et al., 2001]. Активация митоКАТФ способствует разобщению электронного транспорта, ускоряя, таким образом, дыхание, что приводит к окислению проксимальных переносчиков электронов дыхательной цепи [Liu et al., 1998]. Согласно данным Гарлида, активация канала приводит к набуханию МХ, что способствует поддержанию архитектуры внутренней мембраны и сохранению активности дыхательной цепи. Это позволяет поддерживать уровень клеточного АТФ и, таким образом, способствует восстановлению функций миокарда во время реперфузии [Garlid, 2000]. Как было показано ранее, набухание матрикса увеличивает скорость окислительного метаболизма, активирует как окисление жирных кислот, так и дыхание и синтез АТФ [Halestrap, 1989].
В 1983 г. был открыт феномен прерывистой гипоксии, важную роль в котором играет активация митоКАТФ [Murry et al., 1983; Liu et al., 1998].
Феномен прерывистой гипоксии был назван «preconditioning» или «ишемической толерантностью» [Murry et al., 1986; Kitigawa, 1990]. Позднее он получил название «феномен ишемической адаптации» (ФИА) [Yellon et al., 1998; Петрищев и др., 2001], и в настоящее время признан наиболее эффективным способом уменьшения размера инфаркта миокарда [Kloner et al., 1998]. Справедливости ради надо отметить, что адаптация, создаваемая кратковременной гипоксией, была обнаружена ранее [Poupa et al.,1966; Meerson et al., 1973].
Клеточные механизмы ФИА в настоящее время широко изучаются. Считается, что защитный эффект является трехступенчатым и включает в себя последовательные триггерные и конечные эффекторные механизмы, причем наиболее вероятным эффектором является митоКАТФ [Garlid et al., 1997; Yellon et al., 1998; Grover and Garlid., 2000; Петрищев и др., 2001].
ФИА развивается в виде двух волн: первая волна проявляется в течение нескольких часов, затем исчезает и снова появляется в виде второй волны [Yellon et al., 1998], которая длится в течение недели, а иногда и месяца [Carroll et al., 2000]. Установлено, что во второй стадии адаптации к гипоксии также участвует митоКАТФ [Wang et al., 2001]. В развитии толерантности к ишемии мозга [Lacza et al., 2003], и в дистанционной ишемической адаптации сердца к гипоксии при создании коротких эпизодов окклюзии почечной артерии также задействован митоКАТФ [Pell et al., 1998].
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
