Посевы инкубируют в термостате при 25-30-37° соответственно (чаще 30°) и исследуют еженедельно до 4 недель. При подозрении на Т. verrucosum половину засеянных пробирок следует инкубировать при 37°, так как гриб быстрее растет при этой температуре. Первые признаки роста дерматофитов отмечают с 4 по 12 день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считают отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но в случае фавиформных грибов иногда только на 20-30 день. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков могут быть подавлены более быстро растущими бактериями и плесневыми грибами. В отличие от последних, колонии дерматофитов никогда не бывают черными, голубыми или зелеными. Важно соблюдать асептику при взятии и хранении материала, а также исследовать его в кратчайший срок. При появлении роста желательно произвести отсев с края первичной культуры на свежую среду для получения чистой культуры. Перед инкубацией засеянные и надписанные чашки Петри следует завернуть в полиэтилен или в бумагу для предотвращения быстрого высыхания и вторичного воздушного загрязнения.
3.2 Идентификация чистой культуры
3.2.1 Характеристика колоний
При описании колоний следует отмечать такие признаки как время появления и скорость роста колонии, ее размеры, цвет поверхности и обратной стороны, характер поверхности и ее рельеф, форму и край колонии, ее консистенцию и наличие врастания в субстрат. Характеризуя колонию, указывают на ее отличия от типичных штаммов, что важно для оценки полиморфизма данного вида гриба, а также для выявления атипичных штаммов и новых, редких в России видов.
3.2.2 Микроскопическое исследование культур
При малом увеличении и сильном освещении можно исследовать край колонии через стекло пробирки, так как нити мицелия перемещаются на стекло. Наличие и расположение характерных морфологических элементов (конидии, спирали) в сочетании с культуральными признаками в раде случаев позволяют предвари-. тельно определить вид без приготовления микропрепарата или микрокультуры. При таком исследовании пробирку можно фиксировать рукой или использовать деревянную подставку с вырезом.
Для приготовления микропрепарата фрагмент культуры расщепляют микологической лопаточкой и препаровальной иглой на предметном стекле в капле жидкости (вода, раствор Люголя, лак-тофенол, этанол+вода 1:1, этанол+глицерин + вода 2:4:4) и накрывают покровным стеклом. Культуру для исследования берут из центральной и периферической зоны колонии. Микроскопировать следует вначале под малым (*8), а затем под большим (*40) увеличением сухой системы микроскопа. Элементы гриба измеряют с помощью окулярного микрометра, значение деления которого предварительно определяют объект-микрометром.
3.2.3 Микрокультуры готовят для исследования микроморфологии гриба с целью «го точной идентификации
На центр покровного стекла наносят каплю жидкой среды, содержащую грибные элементы, и устанавливают его каплей вниз на смазанное вазелином кольцо Вантигема или предметное стекло с лункой. Для предотвращения высыхания на дно вносят каплю воды. Можно приготовить микрокультуры в агаровых блоках. Для этого из агара вырезают квадраты размером 10x10 мм, высотой 2 мм и переносят их на предметное стекло. Культуру засевают посередине каждого ребра агарового квадрата, накрывают его покровным стеклом и промежуток между покровным и предметным стеклом заполняют предварительно расплавленным парафином для предотвращения высыхания. Микрокультуры инкубируют во влажной камере (чашка Петри или эксикатор с увлажненной ватой).
При микроскопической характеристике культур следует учитывать септированность мицелия, наличие, характер и способ прикрепления макроконидий и микроконидий, а также структуру мицелия и его образований - спиралей, гребешковых гифов, фавиче-ских канделябров. Наличие и характер хламидоспор не имеют решающего диагностического значения.
3.2.4 Биохимические дифференциально-диагностические тесты
При невозможности идентифицировать штаммы, основываясь только на их морфологических особенностях, применяют тесты для определения некоторых проявлений метаболической активности грибов. Для лабораторной практики разработаны методы определения питательных потребностей и методы определения ферментативной активности дерматофитов.
Определение потребности в источниках питания и витаминах.
Основную минимальную среду (NH4NO3 1,5 г, глюкоза 40 г; MgS04 • 7НгО 0,5 г; КН2РС>4 1 г; агар Дифко 20 г; дистиллированная вода до 1000 мл) растворяют при нагревании и автоклавируют при 0,5 атм 15 мин. Витамины (тиамин 1 мг, i-инозит 250 мг, L-гистидин 150 мг, никотиновая кислота 10 мг) растворяют в 100 мл дистиллированной воды каждый, автоклавируют при 0,5 атм 15 мин и хранят в холодильнике. Перед опытом 2 мл того или иного витамина добавляют к 100 мл остывающей основной среды. Для определения способности ассимилировать углеводы их вносят в основную среду вместо глюкозы до конечной концентрации 1 %. Источники азотистого питания вносят в среду вместо NH4NO3. Контролем служат посевы на основную и обогащенную среду.
Кератинолитическая активность (Тест перфорации волос).
А) Мелко раздробленную очищенную почву стерилизуют в автоклаве 3 дня подряд по 1 часу при 1 атм. и помещают в чашки Петри ровным слоем в 3-4 мм. На поверхности почвы равномерно и не густо распределяют нарезанные на короткие фрагменты (15-20 мм) детские волосы, простерилизованные в автоклаве 2 дня подряд по 20 мин при 1 атм. На поверхность почвенно-волосяной среды наносят взвесь исследуемой культуры в 1-2 мл дистиллированной воды. Посевы инкубируют 4 недели при 22-27° с еженедельным увлажнением среды стерильной дистиллированной водой. Наличие органов-перфораторов или других форм кератиноли-зиса регистрируют путем еженедельной микроскопии волос, на которых происходит развитие культуры гриба.
Б) Полоску фильтровальной бумаги помещают на дно стерильной чашки Петри и покрывают стерильной дистиллированной водой. Вносят нарезанные стерилизованные волосы, 5-6 капель 1 % дрожжевого экстракта и взвесь исследуемой культуры. Инкубируют при 25° 4 недели. Еженедельно микроскопируют волосы на наличие конических органов - перфораторов волосяного стержня. Данный метод применяют для дифференциации Т. equinum, T. raentagrophytes, T. rubrum, a также для получения совершенных форм дерматофитов из почвы.
Дифференциальная среда с молоком, глюкозой и бромкрезол - пурпурным (ВСР + CCG + 0,5 % дрожжевого экстракта) позволяет дифференцировать виды дерматофитов по двум параметрам: за-щелачивание среды (голубая —> пурпурная) и зона просветления вокруг колоний за счет гидролиза молока.
Гемолитическую активность определяют на среде Сабуро рН 6,5 с фосфатным буфером и с 5 % дефибринированной бараньей крови. Эритроциты вносят в остывающий агар, и среду разливают по чашкам достаточно толстым слоем. После посева исследуемых культур чашки инкубируют 2 недели при 27°. О гемолитической способности судят по образованию вокруг колоний зоны просветления вследствие растворения эритроцитов. Зеленоватую окраску этой зоны расценивают как альфа-гемолиз, наличие прозрачной и бесцветной зоны -как бета - гемолиз. Контролем служат незасеянные чашки с 5 % кро-ч вяным агаром. Тест может служить для дифференциации Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также Т. tonsurans и Т. soudanense.
Определение уреазной активности (способности расщеплять мочевину) производят на среде Христенсена с мочевиной. Состав среды: пептон 1 г, NaCl 5 г, КН2РО4 2 г, глюкоза 5 г, агар 20 г, дистиллированной воды до 1000 г. Ингредиенты среды растворяют при нагревании, рН доводят до 6,8 и добавляют 6 мл 0,2 % раствора фенол красного (0,2 г фенолрота растворяют в 20 мл нагретого этанола и прибавляют 80 мл нагретой дистиллированной воды). Среду стерилизуют 20 мин при 0,5 атм, охлаждают до 50° и добавляют 100 мл водного раствора мочевины (стерилизованного через бактериальный фильтр или 15 мин при 0,5 атм). Среду разливают в пробирки, скашивают и посевы инкубируют 7 дней при 25°-30°. Результаты оценивают по наличию и сроку появления красного окрашивания среды, которое является показателем уреазной активности культур. Контролем служат незасеянные пробирки со средой. Тест применяют для дифференциации атипичных штаммов Т. rubrum и Т. mentagrophytes, а также для идентификации Т. gallinae, «африканских» трихофитонов и некоторых видов Microsporum.
Инкубация параллельных посевов при t 25°-30°-37° на скошенном агаре Сабуро. Используется для дифференциации Т. men-tagrophytes и Т. terrestre, а также Т. verrucosum и Т. schonleinii.
IV. Серологические и аллергологические исследования
4.1. Серологические тесты: реакция преципитации в варианте иммунодиффузии в агаровом геле
Сыворотка пациента вносится в центральную лунку, сделанную в агаровом геле, и антигены культур различных видов вносятся в окружающие лунки. Результаты учитываются через 48 и 72 часа инкубации при комнатной температуре и затем через 2-3 дня в холодильнике. Для проверки специфичности линий преципитации в центральную лунку вносится капля 1,5 % ЭДТА, и через 1 час неспецифические линии преципитации исчезают.
4.2 Аллергологические тесты: внутрикожные тесты с трихофи-тином, активным компонентом, которого является галактоманнан-пептид
Углеводный компонент выявляет немедленный тип аллергии (ГНТ), а белковая составляющая связана с выявлением клеточного иммунитета (ГЗТ). Больные, не проявляющие ГЗТ или дающие ГНТ, часто имеют хроническую форму дерматофитоза.
Е. floccosum (синонимы Е. inguinale, E. cruris).
Антропофил. Поражает кожу паховых складок, голеней, межпальцевые складки стоп, ногти.
Первичные культуры развиваются на 4-5 день. Колонии складчатые, куполообразные, мучнистые. Цвет колонии желтый с зеленоватым оттенком, обратная сторона от желтой до коричневой.
При микроскопии культуры видны многочисленные тонко- и гладкостенные, тупоконечные макроконидии с 2-6 перегородками, одиночные или по 2-8 в виде гроздьев бананов. Микроконидии отсутствуют. При старении культур появляются хламидоспоры и арт-роспоры. Минимальная ингибирующая концентрация гризеофульви-на, подавляющая рост культур Е. floccosum, составляет 1 мкг/мл.
Род Microsporum
М. audouinii. Антропофил. Поражает волосистую часть головы у детей с флюоресценцией волос и гладкую кожу.
Первичные культуры развиваются на 6-8 день. Колонии медленнорастущие, плоские, пушистые, с радиальными складками. Поверхность от белой до кремовой, обратная сторона желтовато-коричневая. При микроскопии видны редкие бугристые, толстостенные макроконидии и полиморфные микроконидии.
В старых культурах многочисленные хламидоспоры. Рост гриба стимулирует добавление к среде никотиновой кислоты. Минимальная ингибирующая концентрация гризеофульвина составляет 1 мкг/мл.
Отличить гриб от сходных культур М. canis можно по слабому росту на полированном рисе, по отсутствию способности гидроли-зоватъ желатин и использовать мочевину, NH4NO3 и трегалозу как единственные источники азотного и углеродного питания.
М. canis (синонимы М. lanosum, M. felineum). Зоофильный дер-матофит (кошки, собаки). Поражает волосистую часть головы у детей с флюоресценцией волос, гладкую кожу и пушковые волосы.
Первичные культуры развиваются на 5-10 день. Колонии евгони-ческих штаммов быстрорастущие, плоские, пушистые. Цвет поверхности от серого до кремового, обратная сторона желто-оранжевая. Дисгонические штаммы кожистые, приподнятые и пигментированные. При микроскопии видны многочисленные веретеновидные, остроконечные макроконидии с бугристой и толстой стенкой (2 мк), состоящие из 3-15 клеток. Встречаются микроконидии.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20
