Приклад 4

Оцінка вдихуваної дози.

Для визначення вдихуваної дози Bec-DLPC ліпосоми розпорошуються образцы, що, збирають у систему, що імітує легені людини, як описано Smaldone et al. , Am. Rev. Respir. Dis 143: 727-37 (1991). Використовуючи респіратор Харварда, аерозольні зразки з розпилювача ATII (швидкість потоку 10 л/хв) збирають у фільтри Whatman GF/F при 15 вдиханнях у мінуту при обсязі одного вдихання 500 мол. Цей основний обсяг одного вдихання, що становить 500 для чоловіків (450 для жінок), визначений по номограмі, пристосованої для обліку частоти подиху, ваги й полу. Аерозольні зразки збирали протягом п’ятнадцятихвилинного періоду розпилення. Кількість циклоспорину A або Будезоніду, що потрапили на фільтри, визначають після екстракції за допомогою ВЕЖХ.

Приклад 5

Аналізи легеневого циклоспорину A: Твердофазна екстракція

Здійснювалися наступні етапи:

1. Після вдихання циклоспорину A-DLPC у вигляді ліпосомного аерозолю виділяють тканина легенів миші. Додають внутрішній стандартний CSD 10 мкг (1 мкл 1/мг/мл вихідного розчину). Тканина гомогенізують або в змішувачі, або в пробірках Wig-L-Bug (використовуючи 4-5 кульок на пробірку).

2. Гомогенізовану тканину екстрагують в 1 мол надчистої води протягом 1-2 мінут. Цей обсяг використовують для одного зразка тканини, а при об'єднанні більш ніж одного зразка, його розбавляють.

3. Додають 2 мол 98-процентного ацетонітрілу/ 2-процентні метаноли й зразки енергійно струшують.

4. Зразки центрифугують на повній швидкості 20 ; супернатант переносять у чисту пробірку й центрифугують 10 хвилин на повній швидкості.

5. Супернатант збирають і додають по 5 мол надчистої води до кожному 1 мол тихорєцького екстракту.

6. Готовлять стовпчик Sep-Pak C18 (Waters Sep-Pak Light для одиничної мишачої тканини) і промивають 5 мл 95-процентного этанола й 5 мл надчистої води. Зразки додають повільно й промивають 5 мол надчистої води й 5 мол 50-процентного ацетонитрила.

7. Елюат переносять у складальну пробірку й елюірують 1 мл метанолу, а потім 0,5 мл води.

8. Забруднення видаляють при промиванні елюату двічі 1,5 мл гексану й відкиданням верхнього шару.

9. Екстрагований елюат випарюють до сухого стану з використанням температури регулювання реактивного середовища з мінімальним потоком повітря.

10. Відновлення проводять в 0,3 мл рухливі фази CSA і зразку у ВЕЖХ.

Приклад 6

Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз будезоніду.

Дослідження за допомогою ВЕЖХ застосовується з різними цілями для визначення: змісту Будезоніду в ліпосомній готовій препаративній формі, ефективності інкапсулірування, змісту Будезоніда в аерозольних зразках, отриманих на моделі легенів. Концентрацію Будезонида визначають за допомогою ВЕЖХ аналізу з використанням автозагрузочного пристрою Waters WISP 717 і стовпчика Waters Nova-Pak C18 (3,9 x 150 мм) при кімнатній температурі. Пік реєструють при 238 нм, використовуючи детектор, що працює при різних довжинах хвиль в УФ і видимої частини спектра з кількісною оцінкою за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Рухлива фаза, що використовується при цих дослідженнях, представляє 50:50 етанол/ метанол при швидкості потоку 0,6 мол у мінуту (див. Anderson & Ryrfeldt, J. Pharm. Pharmacol. 36: 763-65 (1984)). Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу готовлять із вихідного розчину етанолу, що зберігається при -80 0С.

Приклад 7

Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз циклоспорину A.

Циклоспорин A у ліпосомних готових препаративних формах (для визначення змісту циклоспорину A і ефективності інкапсулювання) і аерозольних зразках визначався за допомогою ВЕЖХ. У дослідженні використовувалися автоматичний інжектор зразків Waters (Milford, MA) WISP і стовпчик Supelco LC-1, нагріта до 750С. Рухлива фаза складалася з 50 відсотків ацетонітрілу, 20 відсотків метанолу й 30 відсотків води (див. Charles et al., Ther. Drug Monitor. 10: 97-100 (1988)). Пік реєструють при 214 нм, використовуючи детектор, що працює на різних довжинах хвиль, і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в метанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу одержують із вихідного розчину метанолу, що зберігається при -800С.

Приклад 8

Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз DLPC

Була використана модифікація схеми проведення ВЕЖХ Grit and Commelin, Chem. & Phys. of Lipids 62: 113-22 (1992). Застосовувалися автоматичний інжектор зразка Waters 717 WISP і колонка-аміно-стовпчик Sperisorb S5 (0,25 см х 4,6 мм, 5 мкм) з рухливою фазою: ацетонітрил, метанол і 10 мМ аміак/трифторуксусна кислота, p 4,8 (64:28:8 по обсязі). Піки реєструють за допомогою випарного-мас-випарного детектора (SEDEX 55, Sedre, France) і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі або метанолі (для розчинення ліпосом).

Приклад 9

Модель легенів для тестування лікарського засобу на мишах: дослідження гострого запалення: (LPS) техніка бронхіолярного лаважа

Ліпополісахарид стінки грамвідемної клітки (LPS) використовувався для індукції, що відновлює, гострого пульмонологического запалення в миші.10-хвилинна експозиція Е. coli 055:B5 LPS (Sigma) аерозолю, випущеного з розпилювача PBsj 1600 (концентрація в резервуарі 100 мкг/мол; доставлена доза 60 нг), викликала сильний флогістичну відповідь, що визначено шляхом акумуляції PMN в альвеолах у відповідь на вироблення хемотаксических цитокінів (визначно на 3 годині; пік відповіді на 6 годині після стимулу). У різний час після застосування аерозолю LPS мишей забивали під метоксифлурною анестезією й знекровлювали через абдомінальну аорту. У трахею хірургічним шляхом вставлялася канюля з PE50 трубкою (зовнішній діаметр 0,965 мм. Clay Adams). Використовуючи збалансований розчин солей по Хенксу в загальному обсязі 2,0 мл (HBSS; Ca/Mg вільний з EDTA), легені зрошували 5 мінут обсягом приблизно в 1,0 мол. Вихід звичайно становив 85 відсотків витягу лаважної рідини. Отримані в результаті білі клітки підраховували за допомогою гемоцитометру, піддавали цитоцентріфугуванню й офарблювали. По різних підрахунках ефект лікарського засобу відзначається по зниженню кількості білих кліток і по зменшенню кількості PNM і/або міелопероксидази позитивних кліток щодо постійних макрофагів і/або міелопероксидази негативних кліток. Це дослідження використовується як стандарт для тестування режиму дії аерозолів, що містять лікарський засіб/ліпосоми, на біологічну активність за допомогою зменшення гострого запального клітинного розростання дихальних шляхів. Фіг. 7 показує протизапальний ефект високих доз Bud-DLPC на легеневий бронхоальвеолярний лаваж (BAL) лейкоцитів у відповідь на виклик LPS (ендотоксину).

Приклад 10

Цитологія: легеневий лаваж          Клітинні препарати (лаваж, тимоцити, лімфовузли або спленоцити) підраховувалися на гемоцитомітрі, піддавалися цитоцентрифугуванню на слайди (використовуючи Miles Cyto-Tek) і офарблювалися за допомогою Wright-Giemsa. May-Grunwald-Giemsa або лейкоцитарна пероксидаза прямо залежить від способу готування. Диференціальний підрахунок був зроблений шляхом мікроскопічного спостереження з масляної імерсії. Біологічний ефект режиму застосування аерозолю з комплексом лікарський засіб-ліпосоми відзначався по зниженню загальної кількості білих кліток і по зниженню числа PMN або міелопероксидази позитивних кліток щодо звичайних макрофагів.

Приклад 11

Інгібірувані антиген/мітоген індукованого лімфоцитарного бластогенезу in vitro за допомогою Cs, виділеного із тканини легенів миші, після аерозольної доставки Cs-DLPC ліпосом (див. табл.A)

Біологічна активність Cs, доставленого в легені з ліпосомним аерозолем. Первинна імунна відповідь для тестування була викликана в пов'язаній із бронхами лімфоїдної тканини й у пов'язаних з легенями медіастинальних лімфатичних вузлах. Після місцевої інтраназальної імунізації мишей лінії Balb/c обложеним квасцами яєчним альбуміном ( AP-OVA (80 мкг), доповнений вакциною Bordetella pertussis) мишей забивали через 7 днів, медіастинальну тканину видаляли й ізолювали лімфоцити для аналізу in vitro. Дослідження проліферації складається в зміні в стимулюванні лімфоцитів після активації сенсибілізіруючим антигеном яєчним білком або неспецифічним T-Клітинним мітогеном, Con А плюс з’єднаною з культурою Cs ізольований із тканини легенів миші при твердофазної екстракції при ВЕЖХ. Поглинання 3[H]-Td у ДНК визначалося протягом 48-72 годин. Інгібірування специфічної або неспецифічної активації лімфоцитів було продемонстровано шляхом знищення або зменшення антиген-специфічного стимулювання або в інгібірування нечутливості до мітогену.

Приклад 12

Фізико-хімічний аналіз.

Просторовий натяг і в'язкість: Просторовий натяг (дини/див) виміряється з використанням Tensiomat (Model 21, Fisher Scientific, Indiana, PA).Платино-Іридієве кільце відомого розміру було піднято з поверхні рідини для тестування при точно контрольованих умовах. "Гадане" значення з дисплея приладу множать на фактор корекції, що включає розмір вимірювального кільця, щільність рідини й інші параметри (відповідно до інструкції виготовлювача). Вимір в'язкості проводять із використанням віскозиметра Gilmont Falling Ball (Gilmont Instruments, Barrington, IL). В'язкість у сантипуазах визначають при кімнатній температурі навколишнього середовища.

Вимір розміру комплексу лікарський засіб-ліпосоми: розмір часток комплексу лікарський засіб-ліпосоми вимірюють із Nicomp Model 370, Submicron Particle Sizer (Program Version 5,0 Nicomp Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Зразки комплексу лікарський засіб-ліпосоми, диспергірувані у воді, аналізували відповідно до інструкції виробника й дані виражали як розмір зважених везикул. Комплекс лікарський засіб-ліпосом має на увазі, що діаметр часток вимірюють із резервуарних зразків у початковому періоді через 10 хвилин розпилення й з аерозольних зразків, виділених з використанням відсікувача AGI-4, як описано Waldrep et al., Int'l J. of Pharmaceutics 97: 205-12 (1993).

Результати на фіг. 9 (графік побудований для концентрації DLPC) демонструють, що відбувається збільшення виходу аерозолю DLPC ліпосом до 170 мг/мл зі зменшенням виходу при більше високих концентраціях. Поширення цих даних на Cs-DLPC ліпосоми дає подібні результати з максимальним ліпосомним аерозольним виходом з 21,3 мг Cs: 160 мг DLPC/мол (фіг. 9). Для ліпосом Bud-DLPC максимальний вихід DLPC аерозолю був продемонстрований з готовою препаративною формою, що складається з 12,5 мг Bud:187,5 мг DLPC/мл. Аналіз порушень розпилення рідкої індиферентної речовини, продемонстрований на фіг. 10 (графік побудований для DLPC), показує залежне від концентрації зниження виходу, як визначено по масі, перетвореної в аерозоль у хвилину.

З підвищенням концентрації ліпосом відбувається супутнє подібне ж підвищення виходу аерозолю аж до критичної крапки (фіг. 11) (графік побудований для концентрації лікарського засобу). Вимір виходу аерозольного лікарського засобу Cs і Bud при ВЕЖХ аналізі показує максимальні концентрації для розпилення (фіг. 11). Для Cs-DLPC ліпосом максимальний вихід становив 21,3 мг Cs: 160 мг/мл. Для Bud-DLPC максимум становив 12,5 мг Bud:187,5 мг DLPC. Фізико- хімічний аналіз цих ліпосомних готових препаративних форм демонстрував паралельне підвищення в'язкості (графік побудований для концентрації DLPC) (фіг. 12). Результати для DLPC, Bud-DLPC і CsA-DLPC були однаковими. В'язкість готових препаративних форм Bud-DLPC була приблизно на 20 відсотків менше, ніж тільки для порожнього DLPC. В'язкість Cs-DLPC була непохитно самою низкою й коливалася між 16 мг Cs/120 мг DLPC і 24 мг Cs/180 мг DLPC/мол. Ці результати припускають, що для кожної готової препаративної форми існує максимальна в'язкість, сумісна з розпиленням аерозолю; вище цих значень не існує додаткового виходу з підвищеною концентрацією комплексу лікарського засобу-ліпосоми.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9