Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерности. Результаты по другим классам других фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.

РН среды. По влиянию рН среды на синтез вторичных соединений данных очень немного. Однако, по имеющимся сведениям, рН среды существенно влияет на этот процесс. Например, при изучении синтеза индола в культуре клеток ипомеи в условиях рН-стата оказалось, что при рН 6,3 синтез индола максимален и в два раза превышает уровень синтеза без рН-статирования. В рН-стате при уровне рН 4,8 синтез полностью прекращается.

Б) Физические факторы.

Аэрация. Очень важный фактор, но практических данных немного. Важно как значение расхода кислорода, так и соотношение СО2/О2. Высокое отношение О2/СО2 может ингибировать и рост и синтез вторичных продуктов.

Температура. Влияние температуры на синтез вторичных метаболитов изучалось лишь в нескольких работах. Показано, например, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при 270, уклонение на 50 в любую сторону приводит к снижению синтеза более чем в 3 раза.

Свет. Этому фактору посвящено наибольшее число работ. При этом разбирается как полная индукция синтезов, так и влияние на количество соединений света разной интенсивности и качества.

Свет увеличивает содержание эпикатехинов и протоантоцианидов в культуре клеток чая, серпентина в барвинке, витамина В6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте. Красный цвет увеличивает синтез подофиллотоксина в культивируемых клетках подофилла.

Достаточно часто освещение изменяет соотношение разных классов вторичных соединений. Например, в культуре клеток Tabernaemontana divaricata под действием света существенно изменялись соотношения аспидосперматановых, коринантиновых, плюмерановых и ибогановых алкалоидов.

В то же время часто свет выключает или снижает синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре клеток дурмана происходит только в темноте, освещение снижает содержание алкалоидов в клетках культуры хинного дерева, шиконина – в культуре клеток воробейника. В последнем случае показано, что свет разрушает ФМН, необходимый для синтеза шиконина.

В) Генетические факторы.

Культуры клеток растений характеризуются большой степенью генетической гетерогенности клеток в популяции. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома – на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются:

А) гетерогенность исходных эксплантов

Б) мутационный эффект компонентов среды культивирования

В) эффект отсутствия организменного контроля («сита мейоза» и др.)

Эта гетерогенность клеточной популяции позволяет с помощью клонирования отбирать линии клеток с сильно изменёнными свойствами, в частности с повышенным синтезом вторичных метаболитов. Таким образом были отобраны штаммы – продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина. Однако судьба отобранных клонов при длительном культивировании различна: в одних случаях синтез вторичных метаболитов в клонах нестабилен и возвращается на уровень исходной культуры, в других случаях клон достаточно стабилен. Причины такого различия в поведении не ясны. Наконец, максимальные изменения генома культивируемых клеток могут быть получены в результате индуцированного мутагенеза. В полученных мутантных штаммах возможны резкие качественные и количественные изменения синтезов вторичных соединений.

3. Культура ткани растений и синтез вторичных метаболитов

3.1 Образование полифенолов в культуре ткани чайного растения

Фенольные соединения (ФС), или полифенолы, занимают одно из центральных мест среди вторичных соединений благодаря их всеобщему распространению в растениях и разнообразным функциям (защита при патогенезах, механических повреждениях и облучении, использование в качестве запасного энергетического материала и др.). Полифенолы имеют также важное биотехнологическое значение (использование в медицине, пищевой промышленности и некоторых других областях народного хозяйства).

В качестве объекта, позволяющего исследовать процессы регуляции образования ФС, была использована культура тканей чайного растения. Известно, что это растение обладает специализированным обменом веществ, направленным на синтез соединений дифенилпропановой структуры (катехина, галлокатехина, катехингаллата.ю галлокатехингаллата).

Каллусные культуры стебля чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность) выращивали в темноте или при непрерывном освещении (3000 лк) при 260 и относительной влажности воздуха 70% на оптимальной питательной среде, содержащей 2,4-Д (2*10-5 М) и глюкозу (2,5%). Содержание суммы растворимых ФС, флаванов и лигнина определяли спектрофотометрическими методами с использованием реактива Фолина –Дениса, ванилинового реактива и 2,6-дихлорхинонхлоримида соответственно.

Гетеротрофная (выращиваемая в темноте ) каллусная культура чайного растения, как и большинство пролиферирующих клеток, обладает более низким биосинтетическим потенциалом, чем исходная ткань интактного растения.

ФС – фенольные соединения; ФЛ – флаваны; ПА – проантоцианидины; ГК – галлокатехины и галловые эфиры катехинов; ФВ – флавонолы; Л – лигнин.

Как видно из представленных данных, в каллусной культуре, происходит как уменьшение общего содержания ФС, так и обеднение их качественного спектра. Однако, способность к синтезу характерных для чайного растения флаванов (представленных простейшими катехинами и их биогенетическими аналогами проанотоцианидинами), а также фенольного полимера лигнина сохраняется. При этом содержание проантоцианидинов и лигнина оказывается даже выше, чем в исходной ткани. Как свидетельствуют данные электронно-микроскопических исследований, это обусловлено, по-видимому, активацией эндомембранной системы клеток (эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи), являющиеся местом синтеза фенилпропаноидных предшественников. Из всего этого следует, что по составу фенольного комплекса и активности фенольного метаболизма гетеротрофная каллусная культура приближается к тканям корня интактного растения.

К числу факторов, способных оказывать влияние на биосинтетический потенциал клетки, относятся гормоны и гормоноподобные соединения, а также свет.

В гетеротрофной каллусной культуре чайного растения НУК (2*10-5 М), введённая в питательную среду взамен 2,4-Д, значительно стимулирует образование растворимых ФС (примерно в 10 раз) и в меньшей степени лигнина (в 3 раза). Это согласуется с литературными данными о том, что НУК может быть использована в качестве ауксина для «продукционных» сред, т. е. сред, способствующих накоплению вторичных соединений.

В отличии от НУК, 1 мг/л кинетина (5*10-6 М) способствует главным образом лигнификации тканей ( в 3 раза по сравнению с контролем), лишь незначительно влияя на образование флаванов.

Таким образом, введением в питательную среду гормоноподобных соединений можно добиться направленной регуляции синтеза определённых типов ФС в культивируемых in vitro клетках и тканях. При этом ауксины (НУК в большей степени, чем 2,4-Д) способствуют синтезу растворимых ФС, в том числе и характерных для чайного растения флаванов, тогда как цитокинины преимущественно воздействуют на образование лигнина. При этом во всех случаях происходит лишь количественные изменения в синтезе ФС, что обусловлено, по-видимому, активацией ферментов лишь тех звеньев фенольного метаболизма, которые являются общими для изученных полифенолов.

Влияние света. Так, перенесение гетеротрофных каллусных культур чайного растения в условия непрерывного освещения во время первых двух субкультивирований приводит главным образом к увеличению образования лигнина ( в 1,5 раза), тогда как образование растворимых ФС несколько снижается.

Влияние длительного освещения на образование суммы растворимых ФС(1), флаванов(2) и лигнина(3) в каллусной культуре чайного растения (в мг/г сухой массы). К – контроль; а – темнота; б, в – свет.

При длительном же пассировании культур в условиях непрерывного освещения (7 культуральных циклов) содержание суммы растворимых ФС, а также флаванов значительно увеличивается. Как показали электронно-микроскопические исследования, это связано с формированием в ткани хлоропластов. Следует также отметить, что такие фотомиксотрофные каллусные культуры помимо флаванов синтезируют ещё один класс характерных для чайного растения ФС, а именно флавонолы. Последние представлены кемпферолом и кверцетином, а также несколькими их гликозидами. Таким образом, формирование в каллусной культуре хлоропластов, являющихся одним из центров синтеза ФС в клетках растений, оказывает значительное влияние на их биосинтетический потенциал и, главное, способствует расширению спектра синтезируемых ФС.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в случае гетеротрофных (не содержащих хлоропласты) каллусных культур усиление образования ФС при действии фитогормонов (ауксинов и цитокининов) или света ( на протяжении первых субкультивирований) происходит лишь за счёт активации ряда ферментов фенольного метаболизма (фенилаланинаммиаклиазы, 4-гидроксилазы коричной кислоты, оксициннамоил-КоА-лигазы и др.). В случае же частично фототрофных (содержащих хлоропласты) культур увеличение образования ФС происходит за счёт двух слагаемых: активации внехлоропластовых ферментных систем (как в первом случае) и благодаря функционированию в хлоропластах специализированного центра биосинтеза ФС.

3.2 Образование b-карболиновых алкалоидов в культуре ткани гармалы обыкновенной

Гармала обыкновенная (Peganum harmala) – лекарственное растение, относящееся к семейству парнолистниковых (Zygophyllaceae) и широко применяемое в народной и официальной медицине. Терапевтический эффект экстрактов гармалы, обладающих значительным влиянием на сердечно-сосудистую деятельность и на центральную нервную систему, обусловлен содержанием в ней алкалоидов, которые оказывают ингибирующее действие на такие ферменты, как моноаминооксидаза и ацетилхолинэстераза. Помимо этого, алкалоиды гармалы проявляют антибактериальную активность, которая увеличивается при использовании УФ-света, что свидетельствует об их фототоксичности.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5