Применение системы с использованием ДНК-зондов позволяет в 2—4 раза, по сравнению с культуральным методом, сократить время, необходимое для выявления микобактерии туберкулеза. Но наиболее перспективным для применения в практических лабораториях оказался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий проводить идентификацию микобактерии туберкулеза в клинических образцах в течение 48 ч.
Аналитическая чувствительность метода составляет от 1 пкг до 5 фг микобактериальной ДНК в образце, что эквивалентно выявлению единичных (1—10) клеток.
Оценка различных систем амплификации показала, что чувствительность метода составляет от 80 до 97%. С помощью метода прямой амплификации рРНК микобактерий туберкулеза выявляют в 96,3% клинических и в 97,7% культуральных образцов. Совместное использование в ПЦР-анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность определения до 98%. При исследовании 3 образцов от пациента чувствительность метода может достигать 100%.
Метод ПЦР позволяет проводить избирательную амплификацию фрагментов нуклеиновых кислот, строго специфичных только для бактерий Mycobacterium tuberculosis, поэтому специфичность ПЦР-анализа микобактерий туберкулеза может составлять до 100%.
Основное преимущество метода ПЦР для диагностики туберкулеза по сравнению с культуральным методом — быстрота получения результата.
На эффективность ПЦР-анализа существенным образом влияет метод подготовки клинического материала. В ПЦР-диагностике туберкулеза для исследований используют практически любые биологические жидкости и биоптаты тканей. При невозможности получения удовлетворительных образцов мокроты у пациентов с подозрением на туберкулез легких методом ПЦР удается обнаружить микобактерий туберкулеза в смывах из ротовой полости.
Особенно ярко преимущества ПЦР проявляются в случаях нелегочных форм инфекции, когда туберкулезную этиологию процесса удается установить при помощи ПЦР в два раза чаще, чем культуральным методом. ПЦР используют для установления диагноза у больных с подозрением на туберкулезный менингит, что позволяет своевременно начать этиотропную терапию. Для анализа используют цереброспинальную жидкость.
Цитогистологические методы
Главная задача цитогистологических методов в лабораторной диагностике туберкулеза это обнаружение специфических туберкулезных изменений (элементов гранулемы). В зависимости от локализации специфического процесса по возможности производится пункция пораженного органа или ткани с последующим цитогистологическим исследованием полученного материала.
исследование мокроты и бронхоскопического материала;
исследования пунктатов лимфатических узлов
исследование соскобов стенки свища при поражениях различной локализации.4. Иммунологические методы:
туберкулинодиагностика;
Туберкулинодиагностика используется при первичной диагностике туберкулеза и оценке активности процесса, представляет собой определение реакции организма на внутрикожное введение туберкулина. Основным методом диагностики туберкулеза у детей является массовая туберкулинодиагностика, что обеспечивает выявление преимущественно ограниченных форм туберкулеза. Среди всех, впервые взятых на учет, ежегодно не менее 77% больных детей выявляется с помощью туберкулиновых проб. Применение туберкулиновых проб у взрослых в качестве скрининга нецелесообразно, т. к. до 80% взрослого населения инфицировано микобактериями туберкулеза.
Туберкулин — препарат, приготовленный из культуры микобактерий туберкулеза (протеиновая фракция) и обладающий их антигенными свойствами. В инфицированном организме при нормальной (или повышенной) иммунологической реактивности в ответ на введение антигенов микобактерий туберкулеза развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).
Виды туберкулина
Альттуберкулин Коха (АТК), или старый туберкулин Коха, представляет собой автоклави-рованный фильтрат 6—9-недельной культуры Mycobacterium tuberculosis.
На смену АТК пришли очищенные стандартные препараты туберкулина Зейберта — РРD-3 (Purified Protein Derivative — очищенный белковый дериват) и М.А.Линниковой — РРD-Л. Названные препараты освобождены от белковых составляющих питательной среды, что увеличивает специфичность реакции организма на туберкулин. На практике применяют стандартные растворы РРD-Л, содержащие 2 ТЕ (для массовых обследований).
Метод туберкулинодиагностики
Принятым методом проведения туберкулинодиагностики для массового обследования населения и в практике противотуберкулезных учреждений в России является внутрикожная проба Манту.
Результат внутрикожной туберкулиновой пробы оценивается как отрицательный (анергическая реакция), либо как положительный, который в свою очередь оценивается как
нормергическая или гиперергическая реакция.
Отрицательная реакция (туберкулиновая анергия), как правило, свидетельствует об отсутствии иммунитета к микобактериям туберкулеза, она наблюдается у людей, не контактировавших с Mycobacterium tuberculosis, и у больных с тяжелой прогрессирующей формой туберкулеза, иммунитет которых не сформировался или подавлен в условиях ослабленного, истощенного организма на фоне злокачественных новообразований, приема иммунодепрессантов, инфекционных и других заболеваний и состояний, приводящих к иммунодефициту. Вирусные гепатиты, корь, коклюш, скарлатина, малярия, саркоидоз, мик-седема, белковое голодание, прием цитостатиков и глюкокортикоидов вызывают у больных туберкулезом снижение или полное отсутствие реактивности к туберкулину. В ряде случаев в результате успешно проводимой терапии туберкулеза и сопутствующего заболевания или отмены иммунодепрессантов реактивность у таких больных восстанавливается.
Необходимо иметь ввиду, что отрицательная кожная проба Манту не всегда отражает отсутствие иммунитета, так как при этом могут быть выявлены диагностически значимый титр антимикобактериальных антител и/или положительные клеточные реакции. Наличие ложноотрицательных результатов туберкулиновой внутрикожной пробы связано с нарушениями правил и порядка выполнения исследования. Определить ложность отрицательного результата можно только при проверке срока годности препарата туберкулина (истекший) или знаний медицинского персонала о технике выполнения пробы. В случае выявления ложноотрицательного результата речь не может идти о туберкулиновой анергии. Туберкулинодиагностику следует провести повторно с соблюдением всех правил метода.
Антигенные характеристики туберкулина разных серий и от разных производителей могут быть несхожими настолько, что реактивность к ним у одного и того же больного может существенно различаться. Данное обстоятельство необходимо иметь в виду при сравнении результатов туберкулиновой пробы, полученных в разных учреждениях. Вместе с тем указанное антигенное различие туберкулиновых препаратов может быть полезно при проверке отрицательной реакции пробы Манту (туберкулиновой анергии). Применив препараты нескольких серий, можно выявить реактивность на один из них, хотя такой результат потребует проверки на специфичность методом повторения пробы в короткие сроки.
Положительная нормергическая реакция наблюдается либо вследствие иммунизации вакциной БЦЖ, либо в результате естественного инфицирования М. tuberculosis с последующим формированием иммунитета, предупреждающим развитие туберкулезного процесса.
Гиперергическая реакция, как правило, свидетельствует о заболевании туберкулезом. Перекрестная реакция на туберкулин вследствие гиперсенсибилизации организма непатогенными микобактериями окружающей среды редко наблюдается в северных широтах.
Результаты пробы Манту имеют особую диагностическую значимость при оценке реакции в динамике, поэтому туберкулинодиагностика детям и подросткам должна проводиться ежегодно. Переход отрицательной туберкулиновой пробы в положительную или увеличение размера папулы по сравнению с предыдущим результатом на 6 мм и более называется виражом туберкулиновой чувствительности. При этом конверсия отрицательной реакции в положительную свидетельствует о факте инфицирования человека М. tuberculosis и формировании у него нестерильного клеточного иммунитета; вираж в виде указанного увеличения диаметра папулы — о реактивации туберкулезного процесса.
Проверку специфичности положительной реакции туберкулиновой пробы рекомендуется проводить повторением пробы в короткие сроки — через 1—2 нед после первой. Специфическая реакция организма на туберкулин, в отличие от неспецифической, сопровождается бустерным эффектом, выражающимся нарастанием реактивных проявлений.
методы определения специфических антител к микобактериям туберкулеза (анти-МБТ);
Методы определения специфических антител к микобактериям тубекулеза (анти-МБТ) в литературе иногда называются серологическими методами, однако, это не является правильным термином, так как при лабораторной диагностике туберкулеза антитела могут выявляться не только в сыворотке крови (serum), но и в тканях пораженных органов. Термин «противотуберкулезные антитела» также не совсем корректен, как, например, выражение «противогепатитные антитела» (то есть не может быть антител против болезни, они существуют против патогенов). Методами ИФА, РСК, РНГА определяют иммуноглобулины класса IgG, специфичные к антигенам микобактерии туберкулеза. Самым современным способом определения специфических антимикобактериальных антител является иммуноферментный анализ (ИФА), отличающийся от прежних методик большей стандартизацией реагентов и условий проведения исследования. Усилиями Санкт-Петербургского НИИ фтизиатрии (СПбНИИФ) и Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии (СПбНИИЭМ) им. Пастера была разработана стандартная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза.
Выявление специфических анти-МБТ антител методом ИФА не может быть эффективно использовано при скрининге туберкулеза, как, например, при скрининге ВИЧ-инфекции выявление антител к ВИЧ, в силу его недостаточной чувствительности и специфичности. Число лож-ноположительных результатов, получаемых при использовании отечественных и зарубежных тест-систем, составляет от 5 до 10%. При этом у больных туберкулезом положительные результаты исследования регистрируются только в 45— 70%. Однако в случаях, когда проведение бактериологических, рентгенологических и гистологических исследований не дает желаемого эффекта, информативны методы иммунологической диагностики туберкулеза, направленные на выявление изменений иммунного статуса больного, типичных для специфического процесса.
Обнаружение в периферической крови специфических антимикобактериальных антител (в диагностических титрах), независимо от выраженности специфического клеточного ответа, является одним из характерных, диагностически значимых признаков туберкулеза. Вместе с тем, необходимо иметь в виду, что отсутствие в крови специфических антимикобактериальных антител не является основанием для исключения диагноза туберкулеза, особенно в случаях специфического процесса внелегочной локализации.
По данным СПбНИИФ, в результате комплексного определения специфических антимикобактериальных антител удается выявить серопозитивность у 80—98% наиболее тяжелых больных туберкулезом легких, позвоночника, почек, у 40—60% больных туберкулезом женских гениталий, глаз, периферических лимфоузлов, туберкулезно-аллергическими синовитами.
В патологических очагах в органах и тканях местный иммунный ответ наиболее выражен, поэтому целесообразным является поиск антимикобактериальных антител (иногда с применением провокационных туберкулиновых проб) в биологических жидкостях или экстрактах тканей из анатомических зон поражения или максимально приближенных к ним участков.
При поражениях глаз и в случаях, когда работа с указанными биологическими жидкостями оказывается нецелесообразной или невозможной, существенную помощь в иммунодиагностике туберкулеза оказывает углубленное изучение клеточных реакций, характеризующих специфическую сенсибилизацию В- и Т-лимфоцитов, особенно на фоне пробы Коха.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
