Циклоферон є низькомолекулярним індуктором інтерферону, що визначає широкий спектр його біологічної активності (противірусної, імуномодулюючої, протизапальної, антипроліферативної, протипухлинної та ін.). Препарат індукує синтез раннього a-типу-інтерферону. У тканинах і органах, що містять лімфоїдні елементи, циклоферон індукує високий рівень інтерферону, що зберігається протягом 72 годин. Основними клітинами-продуцентами інтерферону після введення циклоферону є макрофаги, Т- і В-лімфоцити. У залежності від вихідного стану має місце активація тієї чи іншої ланки імунітету. Препарат індукує високі титри альфа-інтерферону в органах і тканинах, що містять лімфоїдні елементи (селезінка, печінка, легені), активує стовбурні клітини кісткового мозку, стимулюючи утворення гранулоцитів. Циклоферон активує Т-лімфоцити і природні кілерні клітини, нормалізує баланс між субпопуляціями Т-хелперів і Т-супресорів [Руденко, 2000, Романцев, 2000].
Циклоферон ефективний у відношенні вірусів кліщового енцефаліту, грипу, гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу папіломи й інших вірусів [Шостакович-Корецкая, 2000].
Імуномодулюючий ефект циклоферона виражається в корекції імунного статусу організму при імунодефіцитних станах різного походження й аутоімунних захворюваннях.
Застосування циклоферона при лікуванні гострого і хронічного вірусного гепатиту С сприяло більш швидкому поліпшенню самопочуття хворих, відновленню апетиту, зникненню жовтяниці. Клінічному поліпшенню відповідала позитивна динаміка біохімічних і імунологічних змін [Ершов , 1999, Солдогуб, 1999].
Аналізуючи данні наведені в огляді літератури слід зазначити, що на даний час використання імуномоделюючих препаратів, таких як аміксин і циклоферон є найбільш вдалим для лікування ВГС. Тому вивчення їх дії при лікуванні гепатиту С є доцільним.
2. Матеріали і методи
Нами проводилося дослідження лікувальної ефективності застосування імуномоделюючих препаратів у хворих на хронічний гепатит С. Дані отримували при вивченні клітинного, гуморального імунітету та біохімічних тестів у хворих, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у НІІ очних хвороб і тканинної терапії ім.. В.П. Філатова.
Матеріалом для дослідження була кров хворих на гепатит С.
2.1 Визначення показників клітинного імунітету
Визначення вмісту лімфоцитів і лейкоцитів у крові
Зважили пробу, отриману в результаті з'єднання 0,008 мл крові і 0,1 мл 10 % розчину оцтової кислоти в процесі забору крові, ретельно перемішали наконечником піпетки і заповнили нею камеру Горяєва. Підрахували кількість лімфоцитів і лейкоцитів (клітки крові чітко розрізнялися за формою ядра (у 20 великих квадрантах із застосуванням об'єктива х40).
Абсолютний вміст кліток а 1 мкл крові визначали по формулах:
Лей =К*а /1000
де Лей — вміст лейкоцитів у крові, тис/мкл
а — кількість лейкоцитів, у 20 великих квадрантах камери
Горяева.
Лі = К*б /1000
де Лі — вміст лімфоцитів у крові, тис/мкл
б — кількість лімфоцитів, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.
К — коефіциєнт перерахунку: тут К= 169.
Визначення комплексу показників розеткоутворення і фагоцитозу
Приготування суспензії лейкоцитів
Лейкоцити, що містяться в суспензії, отриманої в результаті лізису еритроцитів у процесі забору крові, осадили центрифугуванням планшета при 200 д протягом 5 хв., надосадкову рідину злили із планшета. До отриманого осаду лейкоцитів долили 0,2 мл середовища 199, і одержали суспензію лейкоцитів, яку використали для постановки комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу.
Постановка реакції розеткоутворення і фагоцитозу
Реакції розеткоутворення і фагоцитозу ставили у 96-лункових планшетах для імунологічних реакцій однократного застосування, що мали лунки обсягом 0,2 мл із круглим дном. Для герметизації в кришку планшета вкладали поліетиленову прокладку, яка вирізувалася з упакування планшета. Кришку закріплювали на планшеті за допомогою резинки.
Е- розеткоутворення (Т-лімфоцити)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії лейкоцитів. Доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана. Центрифугували при 200 д протягом 5 хв., потім інкубували при +4°С протягом 30 хв.
М- розеткоутворення (В-лімфоцити)
Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів миші.
Д-фагоцитоз нейтрофілів
Тест Д-фагоцитоза нейтрофілів ставили також, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,06 мл 0,1 % суспензії кліток пекараських дріжджів, вбитих нагріванням.
Е-розеткоутворення після інкубації кліток з теофіліном
(теофілін-резистентні Е- розеткоутворюючі лімфоцити - субпопуляція, збагачена клітками, що володіють хелперною активністю)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії кліток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчину теофіліну в середовищі 199. Інкубували при 37 °С протягом 1 години. Далі доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана і ставили реакцію Е- розеткоутворення.
Фіксація і приготування мазків
Після інкубації осаду при + 4 +10°С у лунки обережно, так щоб не зашкодити осад, додавали 0,02 мл фіксатора, приготовленого на основі глутарового альдегіду. Витримували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після цього надосадкову рідину видаляли одночасно з усіх лунок планшета швидким інтенсивним струшуванням. Потім у кожну лунку негайно додавали по 0,05 мл дистильованої води. Осад ресуспендировали у процесі готування мазків. Мазки готували на ацетатцелюлозній плівці у виді краплі, що займає квадрат розміром 9X9 мм. На поверхні прямокутної плівки розміром 90X130 мм міститься 96 мазків.
Можна використовувати флюорографічну плівку шириною 7 см, і мазки займали квадрати 8x8.
Приготування препаратів
Висушені мазки фіксували у метанолі протягом 10 хвилин (чи абсолютному етанолі протягом 20 хвилин). Потім поміщали у розчин метилового зеленого - піроніна. Через 30 хв. мазки виймали, змивали водою, промокали фільтрувальним папіром і сушать у розправленому стані між аркушами фільтрувального папера під вантажем. На висушену плівку наносять тонким шаром розчин канадського бальзаму в ксилолі і накривали ацетатцелюлозною плівкою такого ж розміру, яку щільно притискали. Отримана плівка з 96 препаратами готова до мікроскопії. При відсутності метилового зеленого - піроніна мазки можна фарбувати азуреозином при РН 5-6 протягом 10 хв.
Підрахунок кількості розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток
У препаратах перераховується число розеткоутворюючих лімфоцитів на 50 лімфоцитів і кількість фагоцитуючих нейтрофілів на 50 нейтрофілів із застосуванням об'єктива Х40, при правильному настроюванні світла в мікроскопі по Келлеру. Можна додатково прораховувати в цих препаратах кількість розеткоутворюючих нейтрофілів. За розеткоутворюючу клітку вважали таку клітку, до якої прикріпилося 3 і більша кількість еритроцитів. За фагоцитуючу вважати клітку-нейтрофіл, що захопив 1 чи більшу кількість дріжджових кліток. Обчислювали % розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток.
Визначення абсолютного вмісту розеткоутворюючих кліток у 1 мкл крові
Е-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * Е - РУЛ / 100%
М-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * М - РУЛ / 100%
де, Е-РУЛ - Е- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкл, %;
М-РУЛ - М- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкс, %;
Лі - вміст лімфоцитів у крові тис/мкл.
Визначення кількості теофілін-чутливих Е-РУЛ
ЕТФ-Ч-РУЛ = Е РУЛ - ЕТФ-Р-РУЛ
де, Е-РУЛ - кількість розеткоутворюючих лімфоцитів (спонтанних), %;
ЕТФ-Р-РУЛ - кількість теофілін-резистентних Е-РУЛ;
ЕТФ-Ч-РУЛ - кількість теофілін-чутливих Е-РУЛ, %.
Постановка комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу
Лейкоцити, отримані в процесі забору крові, осаджували центрифугуванням планшетів. До отриманого осаду лейкоцитів доливали середовище 199, після чого суспензію кліток вносять у лунки чотирьох планшетів за допомогою крапельниць. Після цього в планшети вносять відповідні реактиви, і після постановки реакції готували мазки. Усі реактиви вносять у лунки планшетів за допомогою крапельниць. Мазки залишали до повного висихання. Висушені мазки фіксували у метанолі.
Визначення цитотоксичної активності НК-клітин
Отримували клітини мішеней.
Відмивали у среді і розводили до концентрації 106, 5*105, 105 кл/мл для співвідношення клітина-ефектор – клітина-мішень = 1:10, 1:50, 1:100 відповідно.
Постановка реакції:
Активність НК (цитотоксичність) вимірюють мікроскопічним методом. У пластикові камери з плоским дном, вносять 0,1 мл досліджуємих клітин, по 0,1 мл клітин мишей і культивують при 37оС у вологій камері з 5% СО2 протягом 4-16 годин. В контрольну лунку вносили клітини-мішені і використовували живільне середовище.
Оцінка реакції:
Після культивування підраховували кількість непошкоджених клітин у камері Горєва.
Індекс цитотоксичності визначали по формулі:
ІЦ=100%*а-в/а
Де а – кількість еритроцитів у середовищі без ефекторів,
в – кількість еритроцитів у середовищі з ефекторами
Приготування 10-кратного розчину Хенкса
На 1 л розчину беруть NaCl 80,0 г
КС1 4,0 г
MgS04*7H20 2,0 г
CaCI*6H2O 2,75 г
КН2Р04 0, 6 г
Na2HPO4*2H20 1, 53 г
Глюкоза 10, 0 г.
Розливали у невеликі щільно закриті ємності і зберігали у замороженому стані.
Приготування суспензії еритроцитів барана та мишей
Одержували від барана, перед постановкою реакції еритроцити відмивали у фізрозчині, осаджуючи щораз центрифугуванням при 400 g протягом 10 хв. доти, поки надосадкова рідина не стане безбарвною (звичайно 2 - 3 рази). Для готування суспензії 0,01 мл відмитого залишку еритроцитів змішували з 10 мл середовища 199. Суспензію зберігали при температурі + 4 +10°С не більш трьох годин, перед використанням збовтували.
Кров миші безпородної беруть у пробірку з гепарином, Відмивали і готували так само, як і суспензію еритроцитів барана. Збереження таке ж, як суспензії барана.
Суспензія клітин пекарських дріжджів
Ліофілізовані чи свіжі пекарські дріжджі розводять у фізрозчині (співвідношення 1:5 ) і витримували у киплячій водяній лазні протягом 60 хвилин. Зберігали при температурі О- 4°С до 12 місяців. Перед постановкою реакції дріжджі відмивали розчином Хенкса в тім же режимі, що й еритроцити доти, поки рН надосадкової рідини не буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберігати свій колір). Суспензію кліток дріжджів готували і використовували так само, як суспензію еритроцитів.
2.2 Визначення показників гуморального імунітету
Визначення вмісту імуноглобулінів
Імуноглобуліни класів А, М, G - визначали у плазмі крові методом радіальної імунодифузії в гелі в модифікації методу Манчіні.
Одержання плазми
Планшет-штатив, що містить пластмасові трубочки зі зразками крові, центрифугували при 200° 10 хвилин. Верхню частину трубочки, що містить плазму, зрізували і переносять в інший аналогічний штатив у тім же порядку. Отриману плазму можна тривало зберігати в замороженому стані. Перед постановкою реакції плазму разморажували і переносять у лунки планшета, де розводять фізіологічним розчином у 3 рази (співвідношення плазма - фізрозчин 1:2).
Готування пластин, покритих шаром агару
На кришку 96-лункового планшета, що лежить на нагрівальній підставці (температура 50 °С) у строго горизонтальному положенні, наливали 16 мл розчину агару, що містить моноспецифічну сироватку до імуноглобулінів визначеного класу. Після охолодження на кришці виходить рівний шар гелю. У цьому шарі пробійником вирізували лунки діаметром 2 мм відповідно до розміру лунок стандартного 96-ямкового планшета. Таким чином, на пластині одержували 96 лунок.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
