Микробиологический синтез

Промышленный способ получения химических соединений и других продуктов, осуществляемый благодаря жизнедеятельности микробных клеток, известен под названием микробиологического синтеза. Такие его продукты, как пекарские дрожжи, известны давно, однако широкое использование микробиологического синтеза началось с 50-х гг. XX в. в связи с освоением производства пенициллина. С этого времени начала бурно развиваться микробиологическая промышленность.

В процессе микробиологического синтеза происходит образование сложных веществ из более простых в результате функционирования ферментных систем микробной клетки. Этим он отличается от брожения, в процессе которого также образуются продукты обмена веществ микроорганизмов (спирты, кислоты и др.). Однако брожение сопровождается, наоборот, ферментативным распадом органических веществ. Микробиологический синтез использует способность микроорганизмов размножаться с большой скоростью и выделять избыточные количества продуктов обмена веществ (аминокислот, витаминов и др.), во много раз превышающие потребности микробной клетки. Такие микроорганизмы-продуценты выделяют из природных источников или получают мутантные штаммы, более активные, чем природные. В последние годы в качестве продуцентов применяют культуры, полученные методами генной инженерии, в которых функционирует чужеродный для них ген. Исходным сырьем для микробиологического синтеза органических соединений служат дешевые источники азота (нитраты) и углерода (углеводороды, углеводы, жиры).

Микробиологический синтез включает ряд последовательных стадий, основными из которых являются: подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента, выращивание продуцента, ферментация (культивирование продуцента в заданных условиях) или собственно процесс синтеза, фильтрация и отделение биомассы, выделение и очистка полученного продукта, высушивание.

В настоящее время микробиологический синтез широко используют для промышленного получения аминокислот, витаминов, провитаминов, коферментов и ферментов, нуклеозидфосфатов, алкалоидов и ряда других ЛВ.

Микробиологический синтез витаминов и коферментов все шире включается в новые технологические схемы. Использование достижений в области физиологии микроорганизмов — продуцентов БАВ — позволяет оптимизировать биосинтез и увеличивать их выход. Использование в промышленности указанных методов дает возможность применять более дешевые источники сырья, увеличивать выход продукции, заменять дорогостоящие и трудоемкие стадии химического синтеза.

Изучение химии и биохимии микробных ферментов не только расширяет возможности получения, но и позволяет выявить существование новых витаминов и ферментов. Это открывает пути создания новых ЛВ природного происхождения.

Большинство органических кислот получают химическими методами из продуктов переработки нефти и сухой перегонки древесины. Однако, когда кислота используется для пищевых или медицинских целей или синтез ее является сложным, целесообразно использовать микробиологические методы. Сейчас лимонную, глюконовую, кетогулоновую и итако- новую кислоты получают только микробиологическим путем, а молочную и уксусную — как химическим, так и микробиологическим методами. Многие из этих кислот либо сами являются Л В, либо используются в качестве исходных продуктов их синтеза или получения солей. Основным сырьем для производства органических кислот ранее служили углеводы (глюкоза, сахароза, крахмал). Начиная с 60-х гг. XX в. для этой цели все шире используется непищевое сырье — нормальные парафины нефти в сочетании со специально селекционированными штаммами дрожжей.

Микроорганизмы являются продуцентами аминокислот, используемых в медицинской практике, или полупродуктами синтеза Л В. Производство аминокислот в настоящее время — широко развитая отрасль биотехнологии. В нашей стране широко развито промышленное производство триптофана, лизина, лейцина, изолейцина, пролина и других аминокислот. Технология производства основана на управляемом процессе ферментации с использованием методов традиционной селекции. С этой целью предварительно производится отбор мутантов для создания штаммов — продуцентов той или иной аминокислоты. Такие штаммы являются активными продуцентами аминокислот, в том числе применяемых в медицине.

При получении ряда ЛВ используется микробиологическая трансформация органических соединений, т.е. превращение одних органических соединений в другие, осуществляемое ферментами микроорганизмов. Преимущество микробиологической трансформации по сравнению с органическим синтезом заключается в специфичности действия ферментов и выполнении биосинтеза в «мягких» условиях (в водной среде при температуре не выше 100°С), что значительно упрощает технологию. При этом существенно уменьшается образование побочных продуктов и вредных отходов.

Микробиологическая трансформация может быть применена для превращений органических соединений с помощью таких процессов, как окисление, восстановление, аминирование, декарбоксилирование, дезаминирование, гидролиз, метилирование, конденсация, этерификация, галогенирование, изомеризация, расщепление на оптические антиподы, синтез нуклеотидов из предшественников и др.

Установлена таксономическая специфичность ряда микробиологических трансформаций. Так, например, гидроксили- рование стероидов происходит в присутствии ряда грибов, а восстановление стероидов — мукобактерий. Окислению аминогруппы способствует наличие стрептомицетов, а дезаминированию и восстановлению — дрожжи; окисление различных углеводородов и расщепление ароматического кольца происходит под влиянием псевдомонад, а гидроксилирование ароматического ядра — в присутствии артробактерий и т.д.

Сущность биохимического окисления заключается в использовании изолированных органов животных. Так, например, получают 11-оксистероиды, пропуская через изолированные надпочечники или их гомогенаты раствор соответствующего стероида.

Для микробиологического окисления стероидных соединений (например, прогестерона в положении 11) используют микроорганизмы некоторых видов Як^ориз. Такого типа окисление отличается от биохимического сравнительно более простой технологией выделения, очистки и значительным выходом (30-60%) конечного продукта.

В нашей стране микробиологическая трансформация широко используется при промышленном получении стероидных гормонов, в частности преднизолона из гидрокортизона, преднизона из кортизона, гидрокортизона из кортексолона и т.д. Применение микроорганизмов в синтезе таких ЛВ, как кортизон, гидрокортизон и др., позволило во много раз снизить стоимость производства.

Ряд полисахаридов, используемых в медицине в качестве заменителя плазмы крови, также продуцируется микроорганизмами. Перспективным оказалось использование полисахаридов в качестве антисептиков. Ученые Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии на основе оригинального полисахарида создали ранозаживляющую губку — аубазипор, а НИИ вакцин и сывороток — новый антисептический препарат катацел (полимерная соль на основе целлюлозы и аммонийного основания).

Большие преимущества у биотехнологии алкалоидов на основе микробиологического синтеза по сравнению с методами их получения из растительного сырья. Зная биохимические особенности микроорганизмов-продуцентов и механизм биосинтеза алкалоидов, можно направленно управлять процессом микробиологического синтеза, который к тому же не зависит от погодных условий и может быть максимально автоматизирован. Методами селекции и генетики на основе диких штаммов получают высокоактивные продуценты алкалоидов. Большой интерес представляют, например, грибы и, в частности, аскомицеты рода С1а\ч'сер5, синтезирующие эргоалкалоиды.

Ферменты, являясь сложными по химической структуре соединениями, в большинстве случаев могут быть получены только на основе микробиологического синтеза. Ферменты все шире применяются в качестве ЛВ.

Интенсивное развитие биотехнологии открывает новые перспективы практического применения микроорганизмов для получения витаминов и коферментов, создает возможности для совершенствования технического уровня этих производств, внедрения в практику процессов управляемого непрерывного культивирования. Большие возможности создает применение в биотехнологии витаминов таких источников сырья, как углеводороды, низшие спирты и кислоты.

С помощью биотехнологии была решена проблема получения рибофлавина, широко применяемого в медицинской практике. Методы генной инженерии позволяют в бациллах размножать гены, отвечающие за биосинтез рибофлавина. В результате проведенных исследований количество продуцируемого рибофлавина возросло в 4-5 тыс. раз. Микроорганизмы служат продуцентами аскорбиновой кислоты (на ряде этапов ее получения), р-каротина, некоторых цитохромов и нуклеотидов, тиамина, цианокобаламина и др.

Основную часть биотехнологической продукции занимают антибиотики, потребность в которых очень велика. При этом биотехнология позволяет решить две проблемы: увеличить объем производства антибиотиков и вместе с тем уменьшить их отрицательное влияние на организм. Решению этих проблем способствовало создание научным коллективом ВНИИ антибиотиков под руководством акад. АМН С.М. Навашинатак называемых «ключевыхсоединений» для производства новых антибиотиков. Для этой цели из микроорганизмов выделены вещества, ускоряющие процессы образования антибиотиков. Помещенные в специальные полимерные гранулы, они в течение длительного времени позволяют получать новые антибиотики в промышленном масштабе. Реакторы, в которых происходит этот процесс, отличаются высокой производительностью, занимают мало места, отходов практически не дают. Полученное новое поколение антибиотиков имеет более широкий спектр антимикробного действия. Они практически не вызывают аллергических реакций.

Очень активно исследования в области биотехнологии и генной инженерии ведутся в Государственном научном центре — ГосНИИ особо чистых биопрепаратов. Совместно с учеными других НИИ здесь разрабатываются технологии получения ЛП на основе рекомбинантных белков, полипептидов и микроорганизмов; конструируются новые формы доставки ЛС и т.д. На опытном заводе этого НИИ выпускаются генноинженерные препараты: интерлейкин 1, эритропо- этин, интерферон 2 и бактериальный препарат витафлор. Вместе со специалистами Российской военно-медицин- ской академии удалось создать на основе интерлейкина 1-бета ЛП для лечения последствий поражений лучевой и химической природы, а эритропоэтин оказался эффективным при железодефицитной анемии.

Ученые ГНЦ прикладной микробиологии на основе генной инженерии с использованием бактерий Е. coli создали технологию культивирования гибридного белка-предшественника инсулина человека. Это позволит решить проблему производства отечественного инсулина.

В Новосибирском ГНЦ вирусологии и биотехнологии разработаны ЛП на основе рекомбинантных цитокинов. Один из — альнорин — перспективное противоопухолевое средство, а второй — бефнорин — прошел клинические испытания как иммуномодулятор.

Важной отраслью использования микроорганизмов является получение вакцин для медицинских целей. Вакцинам принадлежат большие перспективы в создании новых высокоэффективных ЛС для лечения таких опасных для человека заболеваний, как ВИЧ-инфекция, злокачественные и другие заболевания. Исследователи Вирусологического центра НИИ микробиологии вплотную подошли к созданию суперсовершенной вакцины. Она будет вызывать пожизненный иммунитет после однократного введения, содержать антигены максимального количества возбудителей инфекции, быть безопасной, устойчивой к положительным температурам, вводиться безопасным пероральным путем. И это не утопия, а реальный путь, в основе которого лежит создание генноинженерных, рекомбинантных вакцин. Исследования в этом направлении начались еще в 1982 г. и в результате уже создано несколько рекомбинантных конструкций, в частности вакцин против гепатита В и клещевого энцефалита. Эти вакцины показали гораздо большую безопасность и пониженную реакто- генность по сравнению с вакцинами на основе «родительских штаммов».

Ученые пришли к выводу о том, что лечение ВИЧ-инфекции возможно только с помощью вакцины. Все остальные Л С неэффективны и к тому же нарушают иммунную систему. Из 50 созданных вакцин две дошли до клинических испытаний (испытываются в США и Таиланде). Перспективными оказались вакцины на основе вирусов (в т.ч. убитых вирусов), а также на основе сальмонелл. Наиболее близки к созданию вакцины для лечения СПИДа ученые США. Предполагается ее создание в течение 5 лет, для чего имеется уже специальный фонд (1 млрд долларов). Предполагаемая стоимость такой вакцины очень высока, поэтому в другие страны она попадет не ранее чем через 15-25 лет.

Пути синтеза лекарственных веществ

Подавляющее большинство Л В представляют собой органические вещества.

Органический синтез осуществляется в лабораторных и промышленных условиях. Это раздел органической химии, в котором рассматриваются пути и методы создания новых соединений. Возникновение данного направления органической химии тесно связано с разработкой теории химического строения и накопления данных о химических свойствах органических соединений (вторая половина XIX в.).

В последние десятилетия исследования в области органического синтеза направлены на воспроизведение природных соединений и их аналогов, а также создание теории и надежных методов органического синтеза. В результате были синтезированы сложнейшие по химической структуре природные соединения (алкалоиды, гормоны, витамины, гликозиды, ферменты) и их синтетические аналоги. Синтез органического соединения с заранее заданной структурой осуществляют из относительно простых и доступных соединений, выпускаемых химической промышленностью. Из них формируется будущая молекула.

Получение органического ЛВ — сложный процесс, нередко состоящий из 10-20 стадий и более. Он включает множество технологических операций, основанных на химических, физических и физико-химических методах. Выход готовой продукции зависит от сложности технологии и других факторов. Он колеблется в очень широких пределах (от 1-2 до 50-80%).

Химические реакции, используемые для синтеза органических Л В, можно классифицировать на три основные группы: реакции замещения, реакции превращения заместителей и реакции окисления — восстановления.

Реакции замещения. Эти реакции основаны на замещении атомов водорода в алифатической цепи, ароматическом, гетероциклическом ядре или в функциональной группе различными заместителями. Реакции замещения используют для того, чтобы придать синтезируемому веществу какие-либо новые свойства или получить промежуточный продукт со свойствами, необходимыми для его дальнейшего превращения в ЛВ.

Реакции превращения заместителей. Эта группа реакций основана на химических превращениях заместителей, имеющихся в молекуле промежуточного продукта, чтобы придать ему новые свойства или изменить его реакционную способность.

Реакции окисления — восстановления. Восстановление и окисление — единый процесс, в результате которого одна группа атомов восстанавливается, приобретая при этом электроны, а другая группа атомов окисляется. В окислительно-восстановительных реакциях происходит изменение не только степени окисления, но и состава молекулы.

Различают основной органический синтез и тонкий органический синтез.

Основной органический синтез — промышленное многотоннажное производство органических соединений, осуществляемое из продуктов переработки угля, нефти, природного газа. Основной синтез отличается от тонкого органического синтеза сравнительной малостадийностью. Он осуществляется на крупных производственных комплексах, мировое производство продуктов достигает 180 млн тонн/год. Продукты основного органического синтеза используются в различных отраслях химической промышленности, в т.ч. химико-фармацевтической. Некоторые из них применяют в качестве ЛВ, но главным образом это исходные продукты синтеза органических ЛВ. И в том, и в другом случаях необходима тщательная дополнительная очистка продуктов основного синтеза от различных примесей. Требования к качеству Л В отражены в соответствующей нормативной документации.

Тонкий органический синтез отличается от основного тем, что его продукция представляет собой результат малотоннажного производства органических веществ сложного строения. Осуществляется тонкий органический синтез из продуктов основного органического синтеза. Для него характерны многостадийность, высокие энерго- и трудозатраты, сложное оборудование, использование гибких блочно-модульных систем, автоматических систем управления, привлечение методов биотехнологии, лазерной химии и др. Большое число стадий приводит к образованию не только промежуточных, но и различных побочных продуктов синтеза, а следовательно, требует постадийного контроля качества и дополнительной очистки от примесей и отходов производства.

Поскольку современные ЛВ отличаются сложным химическим строением, тонкий органический синтез — единственный путь синтетического получения субстанций из числа алкалоидов, гормонов, антибиотиков, их аналогов, а также других органических Л В.

Для получения ЛВ используются различные синтетические методы. Более простые по химическому строению органические соединения, имеющие алифатическую, ароматическую, гетероциклическую структуру, получают с помощью полного органического синтеза. Его применяют и для получения ряда природных БАВ: алкалоидов (атропин, кофеин), витаминов (кислота никотиновая), антибиотиков (левомицетин) и др. Исходными продуктами синтеза служат главным образом продукты сухой перегонки каменного угля.

Широкое применение в медицинской промышленности нашел частичный синтез (полусинтез) на основе природных веществ, имеющих сходную с ЛВ химическую структуру. Так получают многие Л В, являющиеся синтетическими аналогами алкалоидов, витаминов, продуктами гидролиза гликозидов, полусинтетические антибиотики, а также аналоги ан- дрогенных, гестагенных, эстрогенных гормонов, анаболические стероидные препараты и др.

Синтез лекарственных веществ — важнейшая составная часть фармацевтической химии. Вместе с тем фармацевтический синтез — составная часть органической химии. Развитие исследований в области фармацевтического синтеза (первый этап) берет свое начало с работ Д.Л. Романовского, И.И. Мечникова и П. Эрлиха после открытия и становления принципов химиотерапии. Затем в 30-х гг. последовала эра создания сульфаниламидов (Г Домагк, О.Ю. Магидсон, М.В. Рубцов и др.), а в 40-х гг. — эра антибиотиков (Э. Чейн, Э. Ваксман, А. Флеминг и др.).

Второй этап развития фармацевтического синтеза связан с установлением химической структуры и получением синтетическим путем витаминов, кортикостероидов, анаболических, противотуберкулезных, противоопухолевых, холинолитических, анестезирующих и других средств (Р. Вудворд, С.А. Гиллер, М.Н. Щукина, H.A. Преображенский, И.Я. Постовский и др.).

Третьим этапом явилось создание простагландинов и нейрогормонов. После классических исследований лауреатов Нобелевской премии Р. Елоу, Р. Гиллемена, А. Шеллы была установлена структура нейрогормонов и синтезированы различные пептиды (Г.И. Чиппенс).

Благодаря успехам современной органической химии удалось осуществить полный синтез многих природных соединений, в том числе таких сложных, как витамин Bij. Некоторые из таких природных БАВ синтезируют в промышленных масштабах. Однако сложность технологических процессов, многостадийность синтеза сдерживают расширение указанного пути получения ряда ценных ЛВ. Это вызывает необходимость разработки направленного органического синтеза, поиска рациональных синтетических схем.

Вторая половина XX в. характеризуется бурным ростом числа работ по синтезу ЛВ и созданием новых синтетических аналогов антибиотиков, стероидных гормонов, ЛВ для лечения нервной и сердечно-сосудистой систем. Были синтезированы и исследованы тысячи БАВ, десятки из них пополнили арсенал ЛВ.

Создание нового, оригинального ЛВ — чрезвычайно сложный и длительный процесс. Из нескольких тысяч синтезированных веществ отбирается лишь около 500 для тестирования на органопрепаратах, из которых до 250 изучаются на животных, 5 допускаются к клиническим испытаниям и только один становится полноценным лекарственным веществом. На его создание уходит от 8 лет (60-е гг.) до 15 лет (90-е гг.). Соответственно растут затраты на разработку ЛС, которые в 90-е гг. XX в. достигли 300-500 млн долл. США.

. Разработка новых методов синтеза Л В, необходимость их тщательной очистки тесно взаимосвязаны с проблемами исследования качества. Большие перспективы в решении этих проблем создает использование комплекса современных физико-химических методов. Применявшиеся ранее химические методы давали лишь ориентировочное представление о наличии тех или иных примесей в ЛВ. Различные хроматографические методы и их сочетание с абсорбционными и другими современными физико-химическими методами позволяют не только идентифицировать, но и количественно определить содержание малых количеств (десятых долей процента) примесей исходных и промежуточных продуктов тонкого органического синтеза. Отраженное в нормативной документации (ФС, ФСП) допустимое содержание примесей устанавливают при проведении доклинических испытаний. Фармакопейный анализ должен подтверждать требования НД к качеству лекарственного средства. От степени чистоты ЛВ во многом зависит терапевтический эффект и наличие побочных явлений.

К вновь создаваемым синтетическим ЛВ предъявляются разносторонние жесткие требования. Как и ЛВ, полученные иными путями, они прежде всего должны обладать более высокой активностью, избирательностью, продолжительностью фармакологического действия по сравнению с уже имеющимися аналогами. Они не должны иметь нежелательных побочных эффектов и токсичности, быть достаточно стабильными при хранении и не содержать недопустимых примесей иных веществ. Эти ЛВ должны иметь достаточно низкую себестоимость и приносить прибыль на фармацевтическом рынке. Только при соблюдении всех указанных требований новое ЛВ будет пользоваться достаточным спросом.

Страницы: 1, 2, 3