Необходимо отметить, что на 14 день после переноса эмбрионов у пациенток проводили определение β-ХГ для выяснения вопроса о наступлении беременности (эффективности программы).
В ходе обследования десяти пациенток был получен следующий результат: у семи женщин наступила беременность (эффективный цикл); у трех женщин – отсутствие беременности (неэффективный цикл).
2.2 Методы исследования сосудисто – тромбоцитарного гемостаза
2.2.1 Определение количества тромбоцитов
Состав набора: адреналин; растворитель для адреналина, 8,5 мл – во флаконе.
Оборудование, материалы, реагенты: пипетки вместимостью 0,05 – 2,0 мл; физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия.
Приготовление анализируемых образцов: венозную кровь центрифугируют при 1000 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (1200g) в течение 15 мин., в результате получают бедную тромбоцитами плазму.
Разведение адреналина: во флакон с адреналином внести 8,0 мл растворителя для адреналина и развести содержимое при комнатной температуре путем встряхивания в течение 10 мин. В результате получают маточный раствор адреналина (500 мкг/мл).
Для приготовления рабочего раствора адреналина из маточного пользуются следующей схемой:
Номер раствора с адреналином
Физиологический(0,9%)
раствор хлорида натрия
Разведение маточного раствора
Конечная концентрация при агрегометрии (0,45 мл плазмы + 0,05 мл раствора адреналина)
1
4,9 мл + 0,1 мл маточн. раствора
1:50
10 мкг/мл
2
1,0 мл + 1,0 мл из раствора 1
1:100
5 мкг/мл
3
1,0 мл + 1,0 мл из раствора 2
1:200
2,5 мкг/мл
Запись агретограмм проводят в соответствии с инструкцией к агрегометру. С помощью растворов адреналина разной концентрации получают запись кривых агрегации тромбоцитов. Наряду с кривыми агрегации на экране отображается количество тромбоцитов в исследуемой плазме. В норме количество тромбоцитов составляет 140 – 400*109/л
2.3 Методы исследования коагуляционного гемостаза
2.3.1 Определение протромбинового времени (Техпластин – тест)
Принцип метода: тромбопластин (фактор III, тромбокиназа) превращает протромбин плазмы крови в присутствии ионов кальция в активный фермент тромбин, трансформирующий фибриноген плазмы крови в нерастворимый фибрин. Измеряется протромбиновое время – время образования фибрина в плазме крови в присутствии ионов кальция и тканевого тромбопластина (растворимого экстракта из мозга человека).
Состав набора: техпластин – лиофильно высушенная тромбопластин-кальциевая смесь, на 5,0 мл суспензии – 4 фл. МИЧ Техпластина в разных сериях составляет 1.1 или 1.2.; контрольная плазма – лиофильно высушенный пул плазмы крови не менее, чем от 20 здоровых людей, на 0,5 мл – 1фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 0,5; 5,0 мл; вода дистиллированная.
Приготовление анализируемых образцов: венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение Техпластина: в один флакон с Техпластином внести 5,0 мл дистиллированной воды. Флакон встряхнуть и выдержать при +370С в течение 20 мин.
Разведение контрольной плазмы: во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин. Разведенную плазму перед исследованием выдержать 25-30 мин. при комнатной температуре.
Проведение анализа:
Определение контрольных (нормальных) показателей:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы.
2. Инкубировать при температуре + 370С 1 мин.
3. Добавить 0,2 мл разведенного Техпластина, имеющего температуру +370С и начать отсчет времени свертывания до образования фибрина.
Аналогично определить протромбиновое время в образцах плазмы больных.
В норме протромбиновое время, измеренное на коагулометре, составляет 12-15 с.
Рассчитывают протромбиновый индекс по следующей формуле:
В норме ПТИ составляет 85 – 105%.
2.3.2 Методы определения АЧТВ ((АПТВ/АЧТВ) – тест)
Принцип метода: определяется время свертывания плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.
Состав набора: кефалин (лиофильно высушенный фосфолипидный компонент) – 2 фл.; каолин (концентрированная суспензия 200:1 в дистиллированной воде), 1 мл – 1 фл.; буфер трис НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 1 фл.; кальция хлорид (концентрированный 20:1 раствор, 5 М), 10 мл – 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 5,0 мл; вода дистиллированная; цилиндр мерный вместимостью 200 мл.
Разведение кефалина: в один флакон с кефалином внести 2,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и энергичном покачивании в течение 2 мин. В результате получают раствор кефалина, который до использования должен быть выдержан при комнатной температуре в течение 60 мин.
Приготовление АПТВ – реагента: концентрированный буфер трис НСl и концентрированную суспензию каолина количественно перенести из флаконов в мерный цилиндр и общий объем довести дистиллированной водой до 200 мл. В результате получают рабочую суспензию каолина. Для приготовления AЧТВ - реагента смешать в пробирке 0,1 мл раствора кефалина с 3,0 мл рабочей суспензии каолина.
Приготовление рабочего раствора хлорида кальция: в день исследования, в соответствии с потребностью, концентрированный раствор хлорида кальция развести дистиллированной водой в 20 раз (1 объем концентрированного раствора + 19 объемов воды).
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл исследуемой плазмы и прогреть ее при +370С в течение 1 мин.
2. В кювету добавить 0,1 мл AЧТВ - peaгeнтa, имеющего комнатную температуру.
3. Через 3 мин к смеси добавить 0,1 мл рабочего раствора хлорида кальция и зарегистрировать время свертывания.
AЧТВ в нормальной плазме составляет 28-38 с.
2.3.3 Определение тромбинового времени (Тромбо – тест)
Принцип метода: заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.
Состав набора: тромбин (лиофильно высушенный, 6-8 ед NIH во фл.) - 4 фл.; контрольная плазма (лиофильно высушенная) - 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1 - 1,0, 10,0 мл; вода дистиллированная;
Приготовление анализируемых образцов: венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. получают бедную тромбоцитами плазму.
Разведение тромбина: в один из флаконов с тромбином внести необходимое количество дистиллированной воды (см. таблицу) и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 2-3 мин.
Ориентировочные значения нормы тромбинового времени свертывания
Объем дистиллированной воды на флакон с тромбином, мл
Время свертывания, сек.,
при коагулометрическом
определении
2,0
11-14
3,0
15-19
5,0
20-29
Разведение контрольной плазмы: во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин.
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы и прогреть ее при +370С в течение 1 мин.
2. В ту же кювету добавить 0,1 мл раствора тромбина и зарегистрировать время свертывания.
Исследование плазмы больного выполняется аналогично.
Чтение результатов: результат выражают в секундах, сравнивают время свертывания контрольной и исследуемой плазмы. В норме ТВ составляет 14 – 17 с.
2.3.4 Определения концентрации фибриногена (Квик – Фг – тест)
Принцип метода: образовавшийся после свёртывания плазмы крови фибрин быстро высушивается и по его весу определяется содержание фибриногена в плазме.
Состав набора: тромбопластин, 1 г – 2 фл.; хлорид кальция (концентрированный 20:1 раствор, 5,54%), 10 мл – 6 фл.; буфер трис – НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 2 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: термобаня на 370; весы торсионные; центрифуга лабораторная; пробирки стеклянные; цилиндр мерный вместимостью 200 мл; ступка фарфоровая с пестиком; вода дистиллированная; бумага фильтровальная.
Приготовление анализируемых образцов: кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Приготовление реагентов:
Приготовление суспензии тромбопластина: навеску сухого тромбопластина (50 мг) поместить в фарфоровую ступку, добавить 1,0 мл физиологического (0,9 %) раствора хлорида натрия или раствора трис – буфера (0,05 М, pH 7,4) и тщательно растирать в течение 2 мин. Затем дополнительно добавить в ступку 4,0 мл выбранного раствора, перемешать с помощью пестика и взвесь центрифугировать при 1000 об/мин (240 g) в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость слить в другую пробирку и использовать для анализа.
Разведение концентрированного буфера: содержимое одного флакона с концентрированным буфером трис – НСl перенести в мерный цилиндр и довести объем дистиллированной водой до 200 мл. Получаем рабочий раствор буфера.
1. В пробирке последовательно смешать 1,0 мл исследуемой бедной тромбоцитами плазмы крови, 0,1 мл суспензии тромбопластина и 0,1 мл 5, 54 % раствора хлорида кальция.
2. Пробирку встряхнуть и поместить на водяную баню при +37оС на 10 мин.
3. Образовавшийся в результате инкубации сгусток перенести на фильтровальную бумагу и высушивают путём сжатия и перемещения сгустка по фильтру.
4. Сгусток фибрина выдержать на открытом воздухе при комнатной температуре в течение 15 – 20 мин и взвесить на торсионных весах.
В норме масса сгустка, полученного из 1 мл плазмы крови, составляет 10 – 20 мг. Содержание фибриногена в г/л находят при умножении массы сухого фибрина на коэффициент 0,2. В норме содержание фибриногена в плазме составляет 2,0 – 4,0 г/л.
2.4 Методы исследования антикоагулянтного гемостаза
2.4.1 Определение активности антитромбина III
Принцип метода: исследуемую плазму обрабатывают сорбентом гепарина, подвергают тепловой дефибрикации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина оценивают активность АТ III в исследуемой плазме.
Оборудование и материалы: коагулометр; набор реагентов для определения активности антитромбина III ООО Технология – Стандарт.
Проведение анализа: в пробирку вносят 0,4 мл раствора тромбина и прогревают на водяной бане (37оС) в течение 2 мин. Параллельно в кювету коагулометра вводят 0,15 мл разведённой плазмы (или раствора фибриногена) и инкубируют при t 37оС не менее 1 мин.
К раствору тромбина в пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой адсорбированной и дефибринированной плазмы, включают секундомер. Через 2 минуты (точно!) инкубируют при той же температуре 0,1 мл смеси, вносят в кювету коагулометра, содержащую разведённую контрольную плазму и начинают отсчёт времени свёртывания. По калибровочной кривой, построенной с применением коагулометра, определяют активность АТ III в процентах. В норме активность АТ III составляет 80 – 120%.
Результаты исследования сосудисто – тромбоцитарного гемостаза представлены на рис. 1.
Общее количество тромбоцитов не менялось на протяжении всей стимуляции, достоверно увеличиваясь только к 14 дню после переноса эмбрионов.
Рис. 1. Количество тромбоцитов в эффективных и неэффективных циклах. Здесь и на рис. 2-6 1- стимуляция суперовуляции, 2- день введения хорионического гонадотропина, 3- день переноса эмбриона в полость матки, 4- 14–ый день после переноса эмбриона. Достоверность отличий:
3.2 Исследование коагуляционного гемостаза
Результаты исследования коагуляционного гемостаза представлены на рис. 2-5.
Концентрация фибриногена постепенно возрастала, начиная с 5-7 дня стимуляции до дня ПЭ, и сохранялась на уровне в 1,4 раза превосходящем исходный до 14 дня после ПЭ.
Рис. 2. Протромбиновый индекс в эффективных и неэффективных циклах.
Также, начиная с 5-7 дня стимуляции, было отмечено достоверное укорочение тромбинового времени. Увеличение протромбинового индекса и укорочение АЧТВ, свидетельствующие о повышении активности факторов внешнего и внутреннего пути свертывания, происходило только к 14 дню. Можно предположить, что полученные изменения являются результатом длительного воздействия высоких концентраций половых гормонов.
Рис. 3. АЧТВ в эффективных и неэффективных циклах.
Рис 4. Тромбиновое время в эффективных и неэффективных циклах.
Рис. 5. Концентрация фибриногена в эффективных и неэффективных циклах.
Таким образом, в результате проведения стимуляции суперовуляции происходит усиление коагуляционного потенциала крови за счет увеличения концентрации основного субстрата свертывания крови – фибриногена и повышения суммарной активности факторов, составляющих как внешний, так и внутренний путь активации гемостаза.
3.2 Исследование антикоагулянтного звена гемостаза
Результаты исследования антикоагуляционного гемостаза представлены на рис. 6.
АТ III практически не изменялся на всем протяжении исследования. Отмечалось лишь достоверное снижение активности АТ III (на 5,1%) ко дню введения овуляторной дозы ХГ (пик стимуляции и уровня эстрадиола).
Рис. 6. АТ III в эффективных и неэффективных циклах.
На фоне наступившей беременности и высокого уровня половых гормонов поддерживаются более значимые изменения гемостазиологических показателей, что может неблагоприятно влиять на развивающуюся беременность. При увеличении коагулятивной активности крови можно наблюдать нарушение (снижение) кровотока в матке, что затрудняет нормальное развитие эмбриона. По-видимому, у пациенток с наступившей беременностью в циклах ЭКО и ПЭ на 14 день после переноса эмбрионов развивается состояние, потенциально опасное для развития тромботических осложнений и ДВС-синдрома. Тем не менее, и в случае отсутствия беременности при ЭКО и ПЭ большинство параметров значительно отличались от исходного уровня.
Выводы
В результате исследования были отмечены следующие изменения в системе гемостаза:
1. Усиление прокоагулянтных свойств сосудистого эндотелия,
2. Наиболее выраженные изменения претерпевают такие лабораторные параметры гемостаза, как:
а. повышение уровня фибриногена,
б. укорочение тромбинового времени.
3. У данных больных развитие беременности сопряжено с повышенным риском.
Страницы: 1, 2, 3, 4
