В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2 - 3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности. Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20% сыворотки. H.influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями.
На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H.influenzae, N.meningitidis и Str. pneumoniae.
Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при +370С.
Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.
Если число выросших колоний мало (1 - 2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.
При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, в также изредка в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки - гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.
При подозрении на энтеробактерии, синегнойную палочку, стафилококк и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии с методическими материалами.
При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L.monocytogenes характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.
Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина.
Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").
При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1 - 2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.
При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.
3-й день исследования
Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН.
Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию, серогруппирование идентификационной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).
Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).
Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы.
На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при +370С на 1 - 2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1 - 2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано раннее).
При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференцирующих стрептококки.
В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).
4-й день исследования
Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и Br.catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа.
Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при +370С, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции преципитации в агаре, а также для определения лекарственной устойчивости.
Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.
При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой капли" из крови, взятой из вены или пальца.
В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.
Кровь, взятую стерильно из вены, засевают на 0,1% полужидкий агар или жидкую питательную среду в отношении 1:10, т.е. 1 - 2 мл крови можно посеять в пробирку с 7 - 10 мл полужидкого агара или 5 - 10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды. После суточной инкубации материал высевают на сывороточный и "шоколадный" агар в чашки Петри. При наличии роста готовят препараты для микроскопии. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с высевами через день. Выделение и идентификацию гемокультур проводят также, как при исследовании спинномозговой жидкости.
При менингококцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в экссудате кожных петехий.
Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70% спиртом. В случае образования некроза в центре петехии экссудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже экссудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1 - 0,2 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вводят в толщу петехии и отсасывают обратно.
Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.
Засеянные чашки инкубируют при +370С 24 часа (в случае отсутствия роста - 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п. 3).
1-й день исследования
Исследуемый материал - слизь с задней стенки глотки - берут натощак или через 3 - 4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке.
Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2 - 3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.
Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или средой обогащения, или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию. При посеве на чашку материал втирают на поверхности небольшого участка (1*2 см) среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.
Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации. На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.
При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через одни сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.
Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяют грелки (+35 - +400С) и немедленно помещают в термостат при +370С.
Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры.
Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном. Засеянные чашки помещают в термостат.
При транспортировке материала на короткое расстояние (1 - 2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2 - 4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят, погруженными в транспортную среду.
Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.
2-й день исследования
Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой-микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3 - 5 колоний). На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через 40 - 48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
