[pic] ммоль/л, где ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 % ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива №1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт). Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic] при 450 нм.
Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности, результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки. Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в 100 мл сыворотки.
Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
[pic]
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
[pic] усл. ед.
2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 % раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет 0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000 об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254 нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах, количественно равных показателям экстинции.
2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека флуоресцентным методом
(Миллер Ю.И., 1994).
Принцип метода:
Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства молекулы альбумина.
Состав набора:
Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт ЭДТА.
Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного альбумина.
Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с сывороткой позволяет определить ОКА.
Определение показателя ЭКА:
К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.
Определение показателя ОКА:
В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.
Подготовка образцов крови к измерениям:
Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут жидкость 2,0 мл полученного образца.
Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.
3. Результаты исследования и их обсуждение
1. Определение показателей уровня интоксикации в сыворотке крови практически здоровых людей
Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА, активность каталазы, уровень холестерина, ЦИК, МСМ, Ит в сыворотке крови 51 донора в возрасте от 20 до 46 лет. Сыворотка крови доноров была получена на ОСПК (областная станция переливания крови) г. Пензы.
Полученные результаты биохимических анализов были подвергнуты статистической обработке, согласно методам и приемам статистического анализа.
По данным комитета экспертов Международной федерации клинической химии по референтным величинам рекомендуется верхняя и нижняя границы нормы на уровне М(1,96?, состояние предболезни М(2?, состояние острой формы М(3?.
Об уровне процессов ПОЛ судили по концентрации вторичного продукта МДА. Содержание количества МДА составляет 3,61(0,07 мкМоль/л. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). У 48 человек значение содержания МДА входит в границы М(1,96?. У 3 человек (5 %) содержание МДА соответствует значению М(2?, что соответствует состоянию предболезни.
Активность каталазы у практически здоровых людей составила 16,7(0,15 мкат/л (табл. 3.1.1). При исследовании активности каталазы в группе доноров отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдали.
Уровень холестерина, определяемый нами у практически здоровых людей составил 4,45(0,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), показатели уложились в границу референтной величины М(1,96?.
Содержание ЦИК, определяемое нами в сыворотке крови практически здоровых людей составило 52,62(3,52 усл. ед. (табл. 3.1.1). 94 % людей по показателям ЦИК входит в границы нормы, а 6% находятся в состоянии предболезни.
Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,280(0,01 усл. ед. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). При исследовании МСМ отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдаем.
У практически здоровых людей определена детоксикационная нагрузка сывороточного альбумина, т.е. определение общей и эффективной концентрации альбумина. Токсичность по альбумину составляет 0,13(0,01 усл. ед. (табл. 3.1.1). Все значения токсичности по альбумину вошли в границы М(1,96?.
Полученные нами данные не имели существенных отличий от значений этих показателей, имеющихся в литературе в сравнении с приложением 2.
Таблица 3.1.1.
Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых людей
|Группа |n |МДА |Активност|ЦИК |МСМ |Ит |Холестер| |обследованных | |мкМоль/л|ь |усл. ед. |усл. |усл. ед.|ин | | | | |каталазы | |ед. | |ммоль/л | | | | |мкат/л | | | | | |Практически |51|3,61(0,0|16,7(0,15|52,62(3,5|0,28(0,|0,13(0,0|4,45(0,6| |здоровые | |7 | |2 |01 |1 |8 |
2. Определение показателей уровня интоксикации в сыворотке крови больных сальмонеллезом
Сыворотка крови больных исследовалась на базе центра госсанэпиднадзора г. Пензы. Исследования биохимических показателей велись в острую фазу заболевания и в период ранней реконвалесценции. Обследовано нами 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет, с целью установления показателей, характеризующих эндотоксикоз: перекисное окисление липидов, уровень холестерина, Ит по сывороточному альбумину, циркулирующих иммунных комплексов, молекул средней массы и активности каталазы. Причем биохимические показатели крови в разгар заболевания отличались от показателей в период ранней реконвалесценции.
Таблица 3.2.1.
Биохимические показатели сыворотки крови у больных сальмонеллезом
|Группа |МДА |Активност|Ит |ЦИК |МСМ |Холестери| |обследованных |мкМоль/л |ь |усл. ед. |усл. ед. |усл. ед. |н ммоль/л| | | |каталазы | | | | | | | |мКат/л | | | | | |Контроль, n=51 |3,61(0,07|16,7(0,15|0,13(0,01|52,62(3,5|0.280(0,0|4,45(0,68| |(практически | | | |2 |1 | | |здоровые) | | | | | | | |Больные (острый|7,19(0,2 |13,09(0.1|0,29(0,01|100,63(4,|0,550(0,0|6,54(0,07| |период) n=30 | |6 | |04 |2 | | |Больные (ранняя|3,87(0,15|15,84(0,1|0,15(0,01|68,9(2,8 |0,310(0,0|4,65(0,7 | | | |9 | | |2 | | |реконвалесценци| | | | | | | |я) n=30 | | | | | | | | |р?0,001 |р?0,01 |р?0,001 |р?0,001 |р?0,05 |р?0,01 |
Так, в ходе исследования выявлено достоверное увеличение количества МДА в сыворотке крови больных сальмонеллезом на 99 % по отношению к контролю, т.е. возрастает в 2 раза. Данные наших исследований подтверждаются сведениями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненко и другими. По данным этих авторов концентрация МДА при сальмонеллезе возрастает в 2-2,5 раза.
Как видно из таблицы (табл. 3.2.1), у больных наблюдается интенсификация ПОЛ.
Под воздействием сальмонеллезного токсина происходит нарушение липидных бислоев клеточных и субклеточных мембран. Накопление в крови первичных и вторичных продуктов ПОЛ идет не в силу количественных изменений в содержании фосфолипидов плазмы крови, а вследствие интенсификации их свободнорадикального окисления. Результатом инициации ПОЛ становится образование критических концентраций продуктов ПОЛ, которые токсичны для организма. Известно, что повышение ПОЛ может приводить к нарушению проницаемости мембран с последующей инактивацией мембранно-ассоциированных ферментных систем, выходом лизосомальных гидролаз в цитозоль, что вызывает повреждение ДНК т другие существенные изменения в структуре и функциональном состоянии клетки [29, 43, 51, 52].
Установлено, что при ряде инфекционных заболеваний развивается антиоксидантная недостаточность. Одновременно снижается актиность ферментов антиоксидантной защиты, в частности каталазы [44].
По нашим наблюдениям, активность каталазы снизилась на 22 % в острый период заболевания по отношению к контролю. В период ранней реконвалесценции показатель активности каталазы приближается к контролю (табл. 3.2.1).
Л.Б. Оконенко, Л.И. Волкова в своих работах отмечает угнетение каталазной активности. В острый период заболевания происходит резкое сокращение антиоксидантной обеспеченности организма [26, 29].
А.С. Волков указывает на то, что в процессе эндотоксикации метаболические расстройства приводят к гиперлипидемии. Это подтверждается данными наших наблюдений. Так, уровень холестерина в сыворотке крови больных сальмонеллезом в среднем составил 6,54(0,07 ммоль/л, что на 46,9% больше контроля (табл. 3.2.1).
Таким образом, гиперхолестеринемия характеризует патологию обмена липидов и липопротеидов [32,45].
В период ранней реконвалесуценции уровень холестерина приближается к контролю [рис. 3.2.1].
Процентное соотношение показателей липидного обмена при эндотоксикозе, вызванном сальмонеллезной инфекцией
Рис. 3.2.1.
Анализируя результаты проведенных исследований, мы установили, что содержание ЦИК в плазме крови больных сальмонеллезом на 91 % больше, чем в контроле [рис. 3.2.2]. Полученные данные согласуются с выводами исследования И.А. Ильинского, Т.В. Лукинской и других. Повышенное содержание ЦИК говорит о снижении антителообразования в присутствии избытка антигенов. В подобной ситуации ЦИК индуцирует острое иммунное воспаление, сопровождающееся повреждением эндотелия сосудов и почечных клубочков, активацией кининовой системы, что ведет к более серьезным метаболическим нарушениям [46, 47, 48].
Как правило, повышение уровня ЦИК обнаруживается уже в начальный период болезни, на этом же уровне содержание их остается и в острую фазу. Только в стадии реконвалесценции наблюдается понижение показателей [табл. 3.2.1].
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
